流式熒光法檢測(cè)胃蛋白酶原Ⅰ與Ⅱ的評(píng)價(jià)及應(yīng)用分析*

何忠發(fā),駱安德,盧彥蕙,陳耀良,蒙順武,羅雪林,覃 聰

(1.廣西壯族自治區(qū)來(lái)賓市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 546100;2.廣西壯族自治區(qū)來(lái)賓市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 546100)

胃癌組織分泌物中含有胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ(PGⅠ、Ⅱ)，測(cè)定PG有助于分析胃的分泌能力。血清PGⅠ、PGⅡ水平的變化可以反映胃黏膜的功能，因此對(duì)其準(zhǔn)確的測(cè)定在胃癌早期的篩查與療效監(jiān)測(cè)上具有重要意義。流式熒光法是基于熒光編碼微球和流式技術(shù)的一種臨床應(yīng)用型高通量發(fā)光檢測(cè)技術(shù)，具有通量高、配套試劑多、應(yīng)用領(lǐng)域廣、重復(fù)性好，既能檢測(cè)蛋白質(zhì)又能檢測(cè)核酸等優(yōu)點(diǎn)[1]。因此，流式熒光法被廣泛應(yīng)用于胃部疾病的檢查?；瘜W(xué)發(fā)光法也是臨床常用檢測(cè)方法之一。有研究顯示，流式熒光法與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ的結(jié)果在中等濃度方面基本一致[2-3]。但是對(duì)低濃度檢測(cè)的研究也是分析該方法的重要方面，本研究對(duì)流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ的方法學(xué)進(jìn)行評(píng)估，并與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，探討兩種檢測(cè)方法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ上的差異。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年12月至2015年9月來(lái)賓市人民醫(yī)院收治的胃疾病患者155例(患者納入例數(shù)參考文獻(xiàn)[4])，其中淺表性胃炎44例，萎縮性胃炎42例(幽門(mén)螺桿菌感染29例，無(wú)幽門(mén)螺桿菌感染13例)，胃癌69例(早期39例，晚期30例)；年齡22～79歲，平均(39.9±22.9)歲。選取同期在來(lái)賓市人民醫(yī)院體檢健康者145例，年齡23～80歲，平均(40.3±12.6)歲，無(wú)胃部疾病。兩組研究對(duì)象一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2儀器與試劑 PGⅠ、PG Ⅱ流式熒光定量測(cè)定試劑盒(上海透景生命科技有限公司)，Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀(上海透景生命科技有限公司)；PGⅠ、PGⅡ化學(xué)發(fā)光微粒子免疫測(cè)定試劑盒(美國(guó)Abbott公司)，i-2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)Abbott公司)。

1.3方法

1.3.1PGⅠ、PGⅡ檢測(cè) 流式熒光法嚴(yán)格按照流式熒光定量測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，采用Luminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀進(jìn)行PGⅠ、PGⅡ定量測(cè)定；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法按Abbott公司試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 測(cè)定0.4、1.0、5.0、10.0、50.0、200.0 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混標(biāo)液中PGⅠ、PGⅡ水平，建立回歸方程，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)(r)。

1.3.3流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ的評(píng)價(jià)試驗(yàn) 取10 ng/mL PGⅠ、PGⅡ混標(biāo)溶液進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，根據(jù)峰面積計(jì)算PGⅠ、PGⅡ檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)[5]；取9份淺表性胃炎患者血清樣本進(jìn)行回收試驗(yàn)，參考王紹亮等[6]的回收試驗(yàn)方法，計(jì)算9個(gè)樣本PGⅠ、PGⅡ的水平，以平均值表示樣品中PGⅠ、PGⅡ的初始水平；取同一胃炎患者血清樣本4份分別加入0.4、10.0、200.0 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ混標(biāo)液，然后測(cè)定PGⅠ、PGⅡ的水平，計(jì)算回收率=[(測(cè)定待測(cè)回收樣本濃度均值-測(cè)定基礎(chǔ)樣本濃度均值)/加入濃度]×100 %；在不同水平的PGⅠ、PGⅡ中加入干擾劑三酰甘油200 mg/mL、膽紅素20 mg/mL、血紅蛋白 20 mg/mL，計(jì)算回收率以分析抗干擾能力。

1.3.4靈敏度和特異度實(shí)驗(yàn) 以胃鏡和病理診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)兩種方法的靈敏度、特異性進(jìn)行比較，靈敏度=真陽(yáng)性人數(shù)/(真陽(yáng)性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%，特異度=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽(yáng)性人數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ基本參數(shù)分析 流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ線性回歸方程為Y=62.49X+1.61和Y=41.18X+2.85，r=0.998 5、0.998 8，線性范圍為0.35～190.00 ng/mL和0.32～200.00 ng/mL檢出限為0.02 ng/mL和0.04 ng/mL。

2.2流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ評(píng)價(jià)試驗(yàn) 流式熒光法檢測(cè)10 ng/mL的PGⅠ、PGⅡ結(jié)果分別為9.3、9.1、9.5、9.8、9.2 ng/mL和9.5、9.0、9.2、9.9、9.3 ng/mL，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.96%和3.65%；流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ在基礎(chǔ)濃度4.51 ng/mL和2.74 ng/mL，加入濃度為0.4、10.0和200.0 ng/mL的平均回收率為98.3%～100.1%和95.8%～100.0%；流失熒光法在PGⅠ和PGⅡ基本濃度為15.66、22.65、23.69 ng/mL和5.69、5.50、5.68 ng/mL，三酰甘油、膽紅素和血紅蛋白水平為200、20、20 mg/mL情況下，回收率分別為99.1%、98.7%、97.0%和91.2%、96.5%、103.5%。

2.3流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分析 流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分別為74.85%，79.02%，而化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度分別為63.81%，63.75%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。

表1 兩種方法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度比較

2.4不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ結(jié)果分析 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ結(jié)果見(jiàn)下表2和圖1，胃癌患者PGⅠ、PGⅡ水平與其他胃部疾病患者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5流式熒光技術(shù)與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果比較 兩種方法線性回歸方程PGⅠ為Y=0.548 5X+2.241，r=0.988 2；PGⅡ?yàn)閅=0.558 7X+1.005，r=0.987 6。PGⅠ/PGⅡ?yàn)閅=0.624 1X+0.325 0，r=0.984 6，見(jiàn)表3。

表2 不同胃部疾病患者PGⅠ、PGⅡ檢測(cè)結(jié)果

注：*P<0.05，與其他類(lèi)型比較，HP為幽門(mén)螺桿菌

圖1 不同胃部疾病PGⅠ、PGⅡ檢測(cè)結(jié)果表3 流式熒光法與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ結(jié)果比較

疾病類(lèi)型n流式熒光法PGⅠPGⅡ化學(xué)發(fā)光法PGⅠPGⅡtPPGⅠtPPGⅡ淺表性胃炎444.51±0.322.74±0.214.51±0.322.74±0.21122 20.652122 20.652HP感染萎縮性胃炎296.11±0.454.02±0.264.51±0.322.74±0.21無(wú)HP感染萎縮性胃炎134.56±0.782.99±0.086.11±0.454.02±0.26早期胃癌398.39±0.696.21±1.024.56±0.782.99±0.08晚期胃癌305.89±1.06*4.89±1.04*3.39±0.691.21±1.02

注：HP為幽門(mén)螺桿菌

3 討 論

胃癌是比較常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前對(duì)胃癌的診斷依然采用胃鏡活檢組織病理學(xué)進(jìn)行檢查，也是確診胃癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法在使用過(guò)程需要花費(fèi)的人力及經(jīng)濟(jì)成本比較高，而且對(duì)患者也會(huì)造成比較大的痛苦，不少人便放棄了對(duì)胃部疾病的檢查[6]。PG流式熒光技術(shù)因其具有高通量、檢測(cè)效率高的特點(diǎn)，在臨床上常用于胃癌的篩查。此方法對(duì)患者造成的痛苦比較小，而且準(zhǔn)確性比較高，受到了廣大患者及學(xué)者的關(guān)注。PG是胃液中胃蛋白酶的非活性前體，在免疫原性上分為PGⅠ、PGⅡ 2 種，PGⅠ由胃底腺分泌，PGⅡ由胃底腺、賁門(mén)腺、幽門(mén)腺和十二指腸的Brunner，S腺分泌，胃底腺黏膜萎縮過(guò)程中，分泌PGⅠ的主細(xì)胞減少，分泌PGⅡ的幽門(mén)腺細(xì)胞增多，PGⅠ/ PGⅡ比值降低[7-8]。

檢測(cè)PG的方法目前報(bào)導(dǎo)的有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、乳膠增強(qiáng)免疫比濁法(PETIA)、時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)[9-10]、光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法(LICA)及化學(xué)發(fā)光法(CLIA)，檢測(cè)PG的參考方法是化學(xué)發(fā)光免疫分析法[10]。本研究的PG流式熒光發(fā)光免疫測(cè)定方法，其分析血清中PG的精密度、準(zhǔn)確度、檢出限、線性，和參考方法Abbott公司化學(xué)發(fā)光法相關(guān)性良好，兩法測(cè)定的結(jié)果具有一致性[10]。本研究通過(guò)流式熒光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度為74.85%、79.02%，而化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ靈敏度和特異度為63.81%、63.75%，流式熒光法檢測(cè)靈敏度和特異度高。本研究通過(guò)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用流式熒光技術(shù)檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ的線性范圍分別為0.65～190.00 ng/mL和0.22～110.00 ng/mL，和其他研究的結(jié)果基本一致[11]?？赡苡捎趦煞N檢測(cè)方法的原理不同，靈敏度和特異度的差距等，導(dǎo)致兩種檢測(cè)方法的線性范圍差別較大。而且流式熒光法精密度和回收率均比較好，可以準(zhǔn)確測(cè)定標(biāo)本中的PGⅠ、PGⅡ。與化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行對(duì)比分析，兩種方法檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ相關(guān)性良好，存在較好的可比性。

綜上所述，流式熒光技術(shù)檢測(cè)PGⅠ、PGⅡ的方法學(xué)性能比較好，與化學(xué)發(fā)光法具有良好的相關(guān)性，可在臨床上推廣應(yīng)用。