肺癌相關腫瘤標記物及miRNAs在肺癌患者血清中的表達及意義*

葉火林，高淑平，劉漢起，畢向軍，孫成暉，譚艷玲

(廣東省陽春市人民醫(yī)院檢驗科 5236000)

肺癌是病死率最高的惡性腫瘤，國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國肺癌患者5年生存率僅為16.1%，大部分的患者屬于非小細胞肺癌，非小細胞肺癌主要分為腺癌和鱗癌兩大類[1]。雖然目前對于肺癌的治療技術(shù)已經(jīng)有了較大的發(fā)展，但肺癌患者的病死率仍然較高，據(jù)不完全統(tǒng)計肺癌早期患者5年生存率達到45%～65%，而晚期肺癌患者5年生存率為14%，由此可見肺癌早發(fā)現(xiàn)和早治療能夠明顯降低肺癌患者的病死率[2]。因肺癌早期癥狀并不明顯即使有癥狀也不典型，影像學檢查發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)的患者有50%的均為良性，且針對早期病變不明顯者也不易發(fā)現(xiàn)，所以對提高肺癌早期診斷率并沒有太大的幫助，若果進行超聲內(nèi)鏡、纖維支氣管鏡或肺穿刺活檢等檢查方式則對患者創(chuàng)傷較大且只是針對已經(jīng)有影像學改變的患者，部分患者不愿意接受[3]。血清腫瘤標記物(sTM)檢測簡便快捷，且只進行抽血檢查，對患者創(chuàng)傷小，目前已被廣泛地運用于肺癌的輔助診斷、療效評價及預后判斷[4]。miRNAs是一種高度保守的非編碼調(diào)控短鏈RNA，長度為20～24 nt，主要與發(fā)育、造血、器官的形成、凋亡和癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關，最新的研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿中存在有大量穩(wěn)定的miRNAs可為肺癌的診斷提供參考[5]。目前對于血清腫瘤標記物(sTM)與miRNAs的檢測均以單獨檢測的形式進行，聯(lián)合檢測方面并未見有文獻報道，本文將sTM與miRNAs進行聯(lián)合檢測旨在進一步提高肺癌的早期診斷率提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年4月至2017年8月本院呼吸內(nèi)科收治的患者與常規(guī)體檢受試者105例進行回顧性分析。根據(jù)患者身體狀況分為3組，對照組為肺部良性病變患者共35例，其中男17例，女18例；肺結(jié)核瘤5例，肺炎9例，支氣管囊腫4例，錯構(gòu)瘤8例，支氣管擴張9例。觀察組患者為經(jīng)纖維支氣管鏡取樣活檢和病理切片檢驗確診為肺癌的患者35例，其中男20例，女15例；鱗癌13例，腺癌17例，小細胞肺癌5例；TNMⅠ期5例，Ⅱ12例，Ⅲ13例，Ⅳ5例。健康組為本院進行常規(guī)體檢的健康受試者共35例，經(jīng)影像學等檢查未發(fā)現(xiàn)有癌癥，且無癌癥家族史。

1.2儀器與試劑 由美國R&D Systems公司生產(chǎn)的Luminex 200流式熒光檢測儀，在檢測前先用儀器專用配套的校準品和質(zhì)控品進行校準，在進行校準質(zhì)控后方可進行標本的檢測。sTM指標選擇細胞角蛋白21-1片段(CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、鱗狀細胞癌相關抗原(SCC-Ag)、糖類抗原125(CA125)、糖類抗原153(CA153)的檢測試劑均購于R&D Systems公司。QPCR分析儀由美國賽默飛世爾公司生產(chǎn)，UVmini-1240型紫外-可見分光光度計由日本島津公司生產(chǎn)，miRcute miRNA 提取分離試劑盒與熒光定量PCR檢測試劑盒均購自于美國賽默飛世爾公司，miR-1、Let-7及表達內(nèi)參miR-22引物由廣州銳博生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1sTM檢測方法 取患者清晨靜脈血5 mL，在3 000 r/min下進行離心10 min，取血清置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫斕焱瓿蓹z測。采用電化學發(fā)光法檢測CYFRA21-1、NSE、SCC-Ag、CA125、CA153，具體的檢測參數(shù)均按說明書要求進行設置。陽性參考值采用R&D Systems公司推薦標準：CYFRA21-1>3.3 ng/L、NSE>16.3 ng/L、SCC-Ag>1.5 ng/L、CA125>35 U/mL、CA153>40 U/mL。

1.3.2miRNAs檢測方法 (1)將冷凍保存的血清標本迅速地進行復溫處理，復溫完成后取400 μL融解血清進行RNA樣本的制備，具體操作按miRcute miRNA試劑盒的要求進行，RNA最終用焦碳酸二乙酯(DEPC)水融解，在紫外-可見分光光度計下進行RNA提取純度檢測，純度達到吸光度(OD)260/280>1.8方可進行下步操作。(2)對目標基因進行PCR擴增，采用20 μL反應體系dNTPmix(100 mmol/L)0.2 μL，Multiscrible逆轉(zhuǎn)錄酶(50 U/μL)1.0 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL，去核酸酶水9.8 L，混合逆轉(zhuǎn)異物1 μL引物，RNA5 μL。具體操作按Takara公司試劑盒要求進行，混勻后離心在冰上放置。RT-PCR反應條件：16 ℃，5 min；42 ℃，30 min；85 ℃，5 min；4 ℃保存。(3)以2×SYBR Green熒光熒光定量預混合液10 μL，PCR擴增產(chǎn)物(以1∶20進行稀釋)2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。QPCR分析儀進行實時熒光定量PCR檢測。反應參數(shù)：95 ℃，1 min；95 ℃，15 s；60 ℃，45 s共40個循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.13組受試者sTM與miRNAs測量值對比 3組受試者sTM與miRNAs比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且除miR-1與Let-7肺癌患者測得值明顯低于其他組外，肺癌患者各指標測得值均明顯高于其他兩組(P<0.05)，見表1、2。

表1 3組受試者sTM指標比較

續(xù)表1 3組受試者sTM指標均值比較

表2 3組受試者miRNAs水平比較

2.23組受試者sTM指標、miRNAs指標單獨檢測與聯(lián)合檢測對肺癌診斷效能對比 各sTM指標、miRNAs指標單獨檢測與聯(lián)合檢測AUC值為0.828～0.953，聯(lián)合診斷AUC值最大(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 3組受試者sTM指標、miRNAs指標與聯(lián)合檢測對肺癌診斷效能對比

圖1 3組受試者sTM指標、miRNAs指標與聯(lián)合檢測對肺癌診斷效能ROC曲線

3 討 論

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，其病死率極高，提高治療成功率的關鍵是早診斷與早治療，目前最為可靠的肺癌診斷方法為纖維支氣管鏡、縱隔鏡或胸腔穿刺等方法取樣活檢，但活檢對患者創(chuàng)傷較大，耗時長、費用高，且一般用于懷疑惡性腫瘤者，對于早期癌癥篩查和連續(xù)性監(jiān)測則無能為力[6-8]。sTM是指特征性存在于惡性腫瘤細胞或因惡性腫瘤細胞異常增殖、宿主對腫瘤刺激反應等產(chǎn)生，并能反映腫瘤的發(fā)生，用于監(jiān)測腫瘤狀態(tài)的一類物質(zhì)，在腫瘤普查、診斷及預后預測等方面扮演著越來越重要的角色，其檢測費用較低、方便快捷[9]。sTM的檢測方法主要有放射免疫分析、酶聯(lián)免疫法、化學發(fā)光免疫法、電化學發(fā)光免疫分析等，但這些所得到的結(jié)果一般都以單指標的形式進行檢測分析，而單一指標檢測特異性不強，對于早期癌癥檢出率不高，容易出現(xiàn)漏診而延誤患者的病情。大部分癌癥患者體內(nèi)可能存在多種的sTM，而一種sTM也可能存在與多種腫瘤中，因此單指標檢測仍無法滿足對癌癥的診斷要求。miRNA屬于小分子RNA的一種，其核苷酸片段只有21～24個，主要起到調(diào)控蛋白質(zhì)合成的作用，與細胞的發(fā)育、分化及凋亡均有密切關系，逐漸被應用于癌癥的診斷。為提高肺癌的早期檢出率，臨床上常對sTM進行聯(lián)合檢測，而對于sTM與miRNAs聯(lián)合檢測的文獻報道并不多，本文對sTM與miRNAs進行聯(lián)合檢測旨在為肺癌的診斷提供參考。

3組受試者sTM與miRNAs指標均有差異，且除miR-1與Let-7肺癌患者測得值明顯低于其他組外，肺癌患者各指標測得值均明顯高于其他兩組(P<0.05)。本文結(jié)果顯示肺癌患者體內(nèi)miR-1水平明顯低于肺部良性病變患者與健康受試者，與文獻[11]報道稱miR-1在肺癌原發(fā)病灶陽性率明顯低于癌旁和正常組織的結(jié)果相似，miR-1是近年來新被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，研究顯示miR-1在肺癌細胞中表達較低，轉(zhuǎn)染miR-1后肺癌細胞的生長會被明顯抑制，提示miR-1與肺癌的發(fā)生與疾病進展呈負相關。Let-7是最早被發(fā)現(xiàn)與癌癥相關聯(lián)的miRNA，有研究者曾將穩(wěn)定表達Let-7的肺癌細胞注入大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)與未注射的大鼠相比，腫瘤的生長明顯得到了抑制，從該實驗的數(shù)據(jù)還發(fā)現(xiàn)Let-7在腫瘤組織中的表達量與原發(fā)腫瘤大小與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)量呈負相關，本文單獨測試結(jié)果與該結(jié)論相一致[12]。CYFRA21-1是一種酸性蛋白質(zhì)，主要存在于肺癌、食管癌等上皮起源的腫瘤細胞內(nèi)，當腫瘤細胞溶解或壞死時可將CYFRA21-1釋放到血液中，研究發(fā)現(xiàn)CYFRA21-1在鱗癌的表達水平明顯高于腺癌和小細胞肺癌所以被認為是肺鱗癌的最佳診斷標志物之一，同時CYFRA21-1還可敏感地反映腫瘤體積大小的變化，可作為進展期肺癌患者化療療效評價指標以減少對患者進行影像學檢查[13]。NSE主要在神經(jīng)分泌細胞與神經(jīng)源腫瘤細胞中，而肺癌中，小細胞肺癌屬于神經(jīng)源腫瘤中的一種，因此本文選擇NSE作為診斷指標之一，研究數(shù)據(jù)顯示NSE與臨床分期的關系并不明顯，但與疾病的預后有著較為密切的關系[14]。SCC-Ag主要存在與宮頸癌、肺癌、食管癌等多種鱗狀細胞癌中，具有較高的特異性，有研究者曾將SCC-Ag與CYFRA21-1聯(lián)合檢測，其對鱗癌型肺癌患者的陽性檢出率達到100%陽性，有利于提高肺癌中鱗癌的診斷[15]。CA125、CA153均是由腺體分泌的上皮黏蛋白，在乳腺癌、肺癌、卵巢癌等多種腺癌中均有較高的表達，目前作為上皮性卵巢癌與子宮內(nèi)膜癌的標志物，雖然不是診斷肺癌的特異性指標，但臨床數(shù)據(jù)顯示肺癌患者體內(nèi)CA153、CA125水平也高于健康人群，可能是因為CA153、CA125屬于腫瘤相關抗原在肺癌組織內(nèi)自行合成與分泌，同時基膜被病灶侵襲下阻擋作用消失導致抗原進入血液，對不同類型肺癌患者檢測顯示腺癌患者CA153、CA125值均明顯高于鱗癌與小細胞肺癌的患者，所以該指標對于腺癌類肺癌的診斷有較高的參考價值[16]。

各sTM指標、miRNAs指標單獨檢測與聯(lián)合檢測AUC值為0.828～0.953，聯(lián)合診斷AUC值最大(P<0.05)。各指標AUC值均大于0.7，說明本文所選擇的各指標對肺癌診斷均有較大的診斷意義，而將sTM與miRNAs聯(lián)合檢測的AUC面積最大，說明聯(lián)合檢測對于肺癌的診斷效能最高。這可能與單獨檢測時各指標所針對的不同類型的肺癌特異性不同，單一指標檢測的敏感性和特異性不足，導致診斷率不高，將sTM指標與miRNAs指標進行聯(lián)合檢測可彌補單項指標檢測的不足，提高診斷效能。本文中單一指標檢測對于肺癌的診斷雖均具有較大的意義，但每個指標所針對的肺癌類型敏感性不同，難免會出現(xiàn)漏診而延誤患者的病情，聯(lián)合檢測可對此進行補充。

綜上所述，結(jié)合sTM與相關miRNA 的檢測有助于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，提高腫瘤診斷的正確性和特異性，為臨床早期診斷提供更充分的依據(jù)，為肺癌的治療研究提供新的診療策略。