燒傷科患者分離金黃色葡萄球菌耐藥性和耐藥基因研究*

殷國民，楊 丹，顧常梅，陶 佳，劉文淼

(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心/寧夏臨床病原微生物重點實驗室，銀川 750004)

近年來，燒傷患者金黃色葡萄球菌感染率越來越高，嚴(yán)重威脅到患者的生命。由于燒傷導(dǎo)致患者皮膚屏障功能喪失和免疫反應(yīng)低下，因此極易發(fā)生感染。金黃色葡萄球菌已成為引起燒傷患者感染的重要病原體，由于抗菌藥物的不合理使用，其耐藥性日益嚴(yán)重[1]。自1961年，第一株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)在歐洲被發(fā)現(xiàn)以來，更多的耐藥菌株陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，其不僅對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥，還對其他抗菌藥物如氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥。隨著金黃色葡萄球菌的耐藥性增加，以及多重耐藥株的出現(xiàn)，抗菌藥物的選擇已成為是燒傷患者治療中的難題[2]。為了解燒傷患者金黃色葡萄球菌分離株耐藥性和耐藥相關(guān)基因的攜帶情況，對2015年1―8月燒傷科患者分離的106株金黃色葡萄球菌進行耐藥檢測和耐藥基因分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年1―8月本院燒傷科住院患者分離的106株金黃色葡萄球菌菌株。同一患者重復(fù)分離菌株不再計入。金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC25923、ATCC29213，ATCC43300購自國家衛(wèi)生和計劃生育委員會臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 5415D微量臺式離心機(Eppendorf，Germany)；RAD300電泳儀(Amersham Biosciences，USA)；PCT2100PeltierPCR擴增儀(Bio-Rad，USA)；GIS2210凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)。Premix Taq DNA polymerase 和100 bp DNA Ladder Marker購自大連寶生物生物工程公司；瓊脂糖購自西班牙Biowest公司；膠紅購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。耐藥基因引物參考文獻[3]由上海生物工程公司合成。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定和藥敏試驗 采用法國生物梅里埃公司VITEK-2 Compact全自動系統(tǒng)，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)2014版藥敏標(biāo)準(zhǔn)進行判斷。按照CLSI2002年標(biāo)準(zhǔn)推薦，應(yīng)用mecA基因檢測MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，即mecA基因檢測陽性為MRSA，mecA基因檢測陰性為MSSA。

1.3.2細(xì)菌基因組DNA制備 無菌條件下將金黃色葡萄球菌接種在血瓊脂平板，35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，挑取6～8個單個菌落，混懸于0.5 mL無菌水中，95 ℃煮沸15 min，12 000 r/min離心5 min后取上清即為細(xì)菌基因組DNA溶液。

表1 PCR引物序列與目的產(chǎn)物長度

1.3.3PCR基因擴增 25 μL反應(yīng)體系包括Premix Taq 酶緩沖液12.5 μL，上游、下游引物和DNA模板各1 μL，雙蒸水9.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，耐藥基因引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

1.3.4產(chǎn)物檢測 取5 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，100 bp DNA Ladder Marker作參照，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并統(tǒng)計。

2 結(jié) 果

2.1標(biāo)本分布 106株金黃色葡萄球菌中，標(biāo)本主要為膿液、創(chuàng)面分泌物及痰液。其中，膿液74株(69.8%)，分泌物19株(18.0%)，痰液7株(6.6%)，導(dǎo)管尖端5株(4.7%)，靜脈血1株(0.9%)。

2.2金黃色葡萄球菌耐藥率 106株金黃色葡萄球菌除對糖肽類抗菌藥物替考拉寧和萬古霉素均高度敏感，敏感率為100.0%外，對利奈唑胺和替加環(huán)素的敏感率均為100.0%。對苯唑西林的敏感率為67.0%。對莫西沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、奎奴普汀/達(dá)福普利和呋喃妥因的敏感率均達(dá)到80%以上，見表2。

表2 106株金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的敏感率(%)

2.3耐藥基因檢測陽性率 通常mecA基因陽性可判斷為MRSA，本組中65株金黃色葡萄球菌均為MRSA。MRSA和MSSA攜帶的耐藥基因存在差異，在65株MRSA 菌株中檢出59株攜帶有氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素耐藥基因，在41株MSSA菌株中檢出6株攜帶有氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素耐藥基因。106株金黃色葡萄球菌中，β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥基因mecA、TEM基因檢測陽性率分別為61.3%和30.2%；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermA、ermB、ermC基因檢測陽性率分別為60.4%、12.3%、56.6%；四環(huán)素類耐藥基因tetM、tetK和氨基糖苷類耐藥基因陽性檢測率見表3。金黃色葡萄球菌耐藥基因PCR擴增結(jié)果見圖1。

表3 MRSA和MSSA耐藥基因陽性率

注：M為DNA Marker DL100；N為陰性對照

圖1金黃色葡萄球菌耐藥基因PCR擴增結(jié)果電泳圖

3 討 論

金黃色葡萄球菌在自然界中分布廣泛，是醫(yī)院感染及社區(qū)感染的常見病原體，可導(dǎo)致多種感染性疾病。燒傷患者由于免疫系統(tǒng)受損，極易受到此菌的感染，皮膚和軟組織感染最常見[4-5]。近年來，隨著金黃色葡萄球菌對抗菌藥物耐藥性的不斷增加，尤其是MRSA的出現(xiàn)，其已成為威脅生命的病原體。MRSA對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類及鏈陽霉素類等多種抗菌藥物同時耐藥，是醫(yī)院感染暴發(fā)流行的常見病原體，成為臨床抗感染治療的一大難題[6]。

本研究結(jié)果顯示，106株金黃色葡萄球菌對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺和替加環(huán)素的敏感率均為100.0%，對其他抗菌藥物的耐藥率較高，與宗自衛(wèi)等[7]的研究結(jié)果一致。mecA基因編碼一種新的青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)，其與β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物親和力極低從而產(chǎn)生耐藥性，是目前鑒定MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)。本組共檢出MRSA 65株，檢出率為61.3%。苯唑西林耐藥率為67.0%，mecA基因陽性率為61.3%，耐藥表型與耐藥基因不一致，推測可能存在其他的耐藥機制，如其他亞型的青霉素結(jié)合蛋白的改變或產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶[8]。TEM基因為常見的β-內(nèi)酰胺酶基因，在球菌和桿菌中廣泛存在，本研究中有32株攜帶TEM基因。

106株金黃色葡萄球菌對慶大霉素耐藥率為67.0%，氨基糖苷類耐藥基因 aac6′/aph2′′陽性率77.0%，耐藥基因檢出率高于耐藥表型，可能與某些菌攜帶該耐藥基因但該基因未表達(dá)有關(guān)。MRSA和MSSA均攜帶有2種氨基糖苷類藥物耐藥基因(aac6′/aph2′′、ant6)，但MRSA以aac6′/aph2′′為主，MSSA以ant6為主。106株金黃色葡萄球菌對紅霉素的耐藥率較高，但紅霉素耐藥基因檢出率較低，推測可能存在其他的耐藥機制[9]。106株金黃色葡萄球菌對四環(huán)素的耐藥機制主要有兩種：(1)tetK和tetL基因編碼的膜蛋白的主動外排作用；(2)tetM基因編碼的細(xì)菌核糖體保護蛋白，阻止了四環(huán)素類抗菌藥物與細(xì)菌核糖體的結(jié)合。金黃色葡萄球菌四環(huán)素耐藥與tetK及tetM基因密切相關(guān)[10]。本研究中，四環(huán)素耐藥基因tetM和tetK基因的陽性率分別為76.4%、20.7%，以tetM基因為主。在tetM陽性菌株中，同時檢測到10株攜帶tetK基因。tetM、tetk在MRSA和MSSA中均有檢出，MRSA以tetM為主，MSSA以tetk為主。

葡萄球菌對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，林可酰胺和鏈霉素(MLS)耐藥的機制主要包括：(1)msrA基因編碼主動外排泵，可對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物和B型鏈霉素耐藥；(2)產(chǎn)生酶滅活抗菌藥物；(3)抗菌藥物作用靶位的改變，即erm基因編碼的RNA甲基化酶對細(xì)菌核糖體23S rRNA基因甲基化，導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物、林可酰胺和鏈陽菌素B耐藥[11]。erm類基因包括ermA、ermB、ermC和ermF，葡萄球菌中以ermA和ermC基因為主，有研究報道MRSA中ermA、ermC基因最常見[12-13]。本研究中，erm基因以ermA和ermC基因為主，陽性檢出率分別為60.4%和56.6%。MRSA以ermA、ermB為主，MSSA以ermC為主。

綜上所述，燒傷科患者感染金黃色葡萄球菌對多數(shù)抗菌藥物耐藥率較高，對萬古霉素和替考拉寧高度敏感，耐藥基因以mecA、ermA、ermC 、tetM和aac6′/aph2′′為主。MRSA耐藥基因陽性率高于MSSA，MRSA的氨基糖苷類藥物耐藥基因(aac6′/aph2′′)、大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因(ermA，ermB)、四環(huán)素類藥物耐藥基因(tetM)均高于MSSA。對于MRSA感染燒傷患者，需將抗菌藥物合理使用和外科手術(shù)相結(jié)合，正確處理燒傷創(chuàng)面，及時治療MRSA感染控制其傳播流行。