感染性心內(nèi)膜炎患者的主要病原菌耐藥基因檢測*

王 佳，高 輝，徐 益，黃云昆，朱雯梅，姚 瑤，俸 玉

(昆明醫(yī)科大學附屬延安醫(yī)院/云南心血管病醫(yī)院檢驗科，昆明 650051)

感染性心內(nèi)膜炎是由病原菌直接感染而引起的心瓣膜、心室壁或鄰近大動脈內(nèi)膜的炎癥性疾病，引起感染的病原體以細菌最常見，也可由真菌、病毒、立克次體、衣原體屬、螺旋體等其他微生物引起。據(jù)目前的文獻報道，感染性心內(nèi)膜炎的病死率高達20.0%，已成為威脅人類健康的重要疾病，故及早的診斷和治療對感染性心內(nèi)膜炎起到重要作用[1]。本研究對本院感染性心內(nèi)膜炎分離的主要病原菌進行耐藥基因檢測，分析耐藥表型與耐藥基因的關(guān)系，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1菌株來源 實驗菌株來自本院2016年9月至2017年3月臨床以Duck標準確診為感染性心內(nèi)膜炎的血培養(yǎng)陽性瓶分離病原菌。

1.2儀器與試劑 抗菌藥物紙片、Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細菌DNA提取試劑盒、Oligo公司的引物、瓊脂糖、Loading Buffer、DNA Marker、Taq酶，水浴箱、離心機、電泳儀、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1標本采集與細菌分離 收集臨床感染性心內(nèi)膜炎血培養(yǎng)陽性標本分離出來的草綠色鏈球菌和葡萄球菌。符合要求的草綠色鏈球菌和葡萄球菌各有5株。

1.3.2藥敏及保存 紙片法測分離細菌的藥敏，然后把細菌保存在-70 ℃低溫冰箱里。

1.3.3DNA模板的制備 用Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 細菌DNA提取試劑盒，按照說明書步驟提取草綠色鏈球菌和葡萄球菌DNA。取5 μL提取產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer混合，點樣，1%瓊脂糖凝膠120 V電泳40 min，用凝膠成像系統(tǒng)分析并記錄結(jié)果[2]。-20 ℃保存DNA待用。

1.3.4PCR擴增 1～5號為草綠色鏈球菌，對草綠色鏈球菌檢測的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因主要是PBP1a、PBP2b、PBP2x，選取肺炎鏈球菌為標準陽性菌株；6～10號為葡萄球菌，對葡萄球菌檢測的耐甲氧西林基因mecA，耐大環(huán)內(nèi)酯類基因ermB。委托歐陽科技公司合成引物。引物序列見表1。

表1 PCR引物

PCR反應(yīng)體系30 μL，包括：細菌DNA 3 μL，引物1 μL(上下游分別0.5 μL)，Taq酶12 μL,剩余超純水補足。反應(yīng)溫度：96 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，擴增40個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min[3]。取5 μL擴增產(chǎn)物與1 μL Loading Buffer混合，點樣，1%瓊脂糖120 V電泳40 min，凝膠成像系統(tǒng)分析并記錄結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1菌株藥敏試驗結(jié)果 選取的1～5號草綠色鏈球菌藥敏試驗結(jié)果(表2)，顯示5株細菌均對青霉素敏感，選為標準陽性對照的肺炎鏈球菌藥敏試驗結(jié)果顯示對青霉素耐藥。6、7、8、10號菌株對甲氧西林耐藥，6、7、8、9號菌株對紅霉素耐藥，見表3。

2.2耐藥基因檢測結(jié)果 圖1、2為草綠色鏈球菌和作為標準陽性對照的肺炎鏈球菌的耐藥基因檢測結(jié)果，可見草綠色鏈球菌未檢測出PBP1a、PBP2b和PBP2x基因，肺炎鏈球菌PBP1a、PBP2b和PBP2x基因均被檢測出。圖3為葡萄球菌檢測結(jié)果，6、7、8、10號菌株檢測出mecA基因，6、7、8、9號菌株檢測出ermB基因。

表2 草綠色鏈球菌對青霉素的藥敏試驗結(jié)果

注：S為敏感；R為耐藥

表3 葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

注：S為敏感；R為耐藥

圖1 草綠色鏈球菌檢測結(jié)果

圖2 草綠色鏈球菌和肺炎鏈球菌檢測結(jié)果

2.3藥敏試驗及基因檢測結(jié)果 5株草綠色鏈球菌均對青霉素敏感，肺炎鏈球菌對青霉素耐藥，對草綠色鏈球菌和肺炎鏈球菌進行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因檢測，草綠色鏈球菌未檢測到這3個基因，肺炎鏈球菌3個基因均為陽性，藥敏結(jié)果和基因檢測結(jié)果見表4，基因型與耐藥表型一致。5株葡萄球菌中，6、7、8號葡萄球菌對紅霉素耐藥且耐甲氧西林陽性，3例菌株均檢測出mecA和ermB基因。9號溶血葡萄球菌對紅霉素耐藥，耐甲氧西林陰性，10號表皮葡萄球菌則相反，對紅霉素敏感，耐甲氧西林陽性，對9、10號進行耐藥基因檢測中，筆者發(fā)現(xiàn)9號溶血葡萄球菌檢測到ermB基因而沒有檢測到mecA基因，10號表皮葡萄球菌檢測到mecA基因而沒有檢測到ermB基因，基因型與耐藥表型一致，藥敏試驗結(jié)果和基因檢測結(jié)果，見表4、5。

圖3 葡萄球菌檢測結(jié)果表4 草綠色鏈球菌和肺炎鏈球菌耐藥基因檢測結(jié)果

編號細菌青霉素耐藥基因檢測結(jié)果1草綠色鏈球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)2草綠色鏈球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)3草綠色鏈球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)4草綠色鏈球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)5草綠色鏈球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)陽性對照肺炎鏈球菌RPBP1a(+)、PBP2b(+)、PBP2x(+)

注：S為敏感；R為耐藥

表5 葡萄球菌耐藥基因擴增結(jié)果

注：S為敏感；R為耐藥

3 討 論

感染性心內(nèi)膜炎是指由細菌、真菌和其他微生物直接感染而產(chǎn)生心瓣膜或心室壁內(nèi)膜的炎癥[2-3]。隨著醫(yī)療技術(shù)地不斷進步，人工瓣膜植入常用于治療心臟病，以及各種侵入性操作的廣泛應(yīng)用，細菌性血癥病例也漸漸增多[4]。常見的病原菌分布較為廣泛，以草綠色鏈球菌、葡萄球菌等條件致病菌相對多見，感染性心內(nèi)膜炎臨床表現(xiàn)多樣，如發(fā)熱、心臟雜音、心力衰竭和脾腫大等，是心臟內(nèi)外科較常見而且難以處理的一種嚴重疾病，其癥狀可以單獨出現(xiàn)也可以伴隨其他疾病，如自身免疫性疾病，給臨床診斷帶來干擾[5-6]。

據(jù)統(tǒng)計，2011―2015年本院感染性心內(nèi)膜炎患者病原菌中共分離出草綠色鏈球菌104例，占37.1%，為主要病原菌；表皮葡萄球菌30例，占10.7%。草綠色鏈球菌對紅霉素、克林霉素耐藥率較高,均為54.5%；對頭孢噻肟的耐藥率為9.1%，頭孢曲松為2.3%，目前沒有檢測到耐青霉素的草綠色鏈球菌。葡萄球菌對青霉素的耐藥率為100.0%，對紅霉素和四環(huán)素的耐藥率分別為57.1%和61.9%[7]。草綠色鏈球菌主要對紅霉素和克林霉素的耐藥率較高，葡萄球菌普遍對青霉素G、苯唑西林、紅霉素、克林霉素等耐藥。青霉素結(jié)合蛋白(PBPs) 作為β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物作用于細菌的必需蛋白，當細菌編碼PBPs 的基因發(fā)生變異，可以導致PBPs的數(shù)量、種類或與抗菌藥物的親和力發(fā)生變化，造成細菌結(jié)合β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的能力降低，進而導致細菌耐藥性的產(chǎn)生[8]。ermB 基因介導靶位點修飾。ermB 基因編碼核糖體甲基化酶,可使細菌23S rRNA A2058 位點的腺嘌呤殘基N-6 位二甲基化。其耐藥表型為大環(huán)內(nèi)酯類-林可酰胺類-鏈陽菌素B (MLS),即對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類抗菌藥物和鏈陽性菌素B 交叉耐藥,可被分為固有型MLS耐藥(cMLS) 和誘導型MLS耐藥(iMLS),后者表現(xiàn)為僅對大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物耐藥,當耐藥基因被完全誘導時,則表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)型耐藥。mecA基因編碼PBP2a，PBP2a具有其他高親和力PBPs的功能，當高親和力的PBPs被β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物結(jié)合而失去功能時，PBP2a的存在仍能維持細菌生長與存活，使其成為耐藥菌株。因此對感染性心內(nèi)膜炎患者進行主要病原菌耐藥基因檢測是非常有必要的。

本實驗選取了5株草綠色鏈球菌和5株葡萄球菌進行基因檢測，所有細菌DNA均提取成功。對草綠色鏈球菌進行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因檢測(圖1)，選肺炎鏈球菌為標準陽性菌株進行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因檢測(圖2)。從圖中可以看出草綠色鏈球菌基因擴增結(jié)果均為陰性，肺炎鏈球菌基因擴增結(jié)果為陽性，結(jié)合藥敏結(jié)果(表2)中草綠色鏈球菌對青霉素敏感和肺炎鏈球菌對青霉素耐藥可見耐藥基因基因檢測結(jié)果與藥敏結(jié)果一致。同時，本實驗還選取了5株葡萄球菌進行mecA和ermB基因檢測(圖3)，結(jié)合葡萄球菌藥敏結(jié)果表3可見對甲氧西林耐藥菌株均檢測出mecA基因，對紅霉素耐藥菌株均檢測出ermB基因，耐藥表型和基因型相對應(yīng)。

據(jù)文獻報道，草綠色鏈球菌對青霉素耐藥是因為攜帶PBP1a、PBP2b和PBP2x基因編碼導致的，葡萄球菌對甲氧西林和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥，也是由于其攜帶mecA和ermB基因[9-10]。本實驗選取5株對青霉素敏感的草綠色鏈球菌，并未檢測出

其攜帶PBP1a、PBP2b和PBP2x基因，而5例葡萄球菌中，對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥菌株均檢測出ermB，耐甲氧西林陽性菌株均檢測出mecA基因，結(jié)果與文獻報道相符合。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)可以通過耐藥基因檢測，對臨床感染性心內(nèi)膜炎患者早期用藥起到指導作用。本次檢測耐藥基因?qū)嶒灋橐粋€預(yù)實驗，根據(jù)實驗結(jié)果，可以看出該實驗初步條件已成熟，之后可以收集更多病原菌，繼續(xù)開展后續(xù)實驗。完成后續(xù)實驗，將結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，最終掌握本地區(qū)草綠色鏈球菌和葡萄球菌流行的耐藥表型及其相應(yīng)的耐藥基因，促進臨床合理選擇抗菌藥物,提高感染性心內(nèi)膜炎患者的治愈率及生存率。