哮喘與感染患兒外周血中性粒細胞CD64指數(shù)、B淋巴細胞、BTLA的表達差異及臨床意義研究*

唐宗生,許雪梅,秦道建,李志鴻,陶明芬

(1.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院輸血科，安徽蕪湖 241001；2.上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心 200127；3.皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院兒科，安徽蕪湖 241001；4.皖南醫(yī)學院院弋磯山醫(yī)院血液凈化中心，安徽蕪湖 241001)

據(jù)估計，到2025年全世界哮喘患者的數(shù)量將由目前的3億多增至4億[1-2]。數(shù)量龐大，增長之勢迅猛。兒童作為哮喘發(fā)病率較高的群體，其患病情況一直備受關注。哮喘的病理機制是氣道慢性炎癥，主要是氣道的高反應性、阻塞可逆性和可重塑性，表現(xiàn)為反復咳喘、氣促、胸悶、肺部哮鳴音等[3]。影響哮喘發(fā)病的因素眾多，總的來說，由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用決定。臨床上發(fā)現(xiàn)哮喘患者通常合并有感染，感染可能作為哮喘發(fā)病的一個重要誘因，并且可能加重哮喘患者病情，影響患者生活質(zhì)量，增加醫(yī)療費用。本研究以哮喘和一般細菌感染患兒作為研究對象，通過測定兩組外周血中性粒細胞CD64、B淋巴細胞、B和T淋巴細胞衰竭因子(BTLA)、免疫球蛋白E(IgE)、C反應蛋白(CRP)水平，探討其作用機制及臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取皖南醫(yī)學院弋磯山醫(yī)院兒科2015年6月至2017年1月收住入院的49例患兒，其中哮喘組26例(女14例，男12例)，同期一般細菌感染組23例(女10例，男13例)。兩組受試對象在年齡、體質(zhì)量、性別方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組患兒均無其他并發(fā)癥。哮喘患兒及一般感染患兒入院前均未接受治療。本研究獲得家屬知情同意。哮喘組患兒均符合哮喘診斷標準(第8版《諸福棠實用兒科學》)：(1)反復發(fā)作喘息、胸悶、氣促，多與接觸變應原、化學、物理性刺激等有關，常在夜間和(或)清晨發(fā)作或加劇。(2)在發(fā)作時兩肺可聞及以呼氣相為主的散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長。(3)上述癥狀和體征經(jīng)抗哮喘治療有效或自行緩解。(4)除外其他疾病所引發(fā)的喘息、咳嗽、氣促和胸悶。(5)臨床表現(xiàn)不典型者，至少符合以下一項標準，①運動激發(fā)試驗或支氣管激發(fā)試驗陽性。②證明有可逆性氣流受限(滿足以下任意一項)，抗哮喘治療有效，即使用支氣管舒張劑和吸入(或口服)糖皮質(zhì)激素治療1～2周后，第1秒用力呼吸容積(FEV1)增長≥12%；支氣管舒張試驗陽性，即吸入速效β2受體激動劑15 min后的FEV1增長≥12%。③最大呼氣流量(PEF)連續(xù)檢測1～2周，每日變異率≥20%。符合第1～4項或第4、5項者，可以診斷為哮喘。一般細菌感染診斷標準：中性粒細胞絕對值>10×109/L或CRP>10 mg/L或降鈣素原(PCT)>0.5 ng/mL確證，并完善呼吸道病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等檢測，排除病毒及特殊病原體感染。

1.2儀器與試劑 Mouse Anti-Human CD45-PE-CY5溶液(Cat:12-0649；美國eBioscience公司)、Mouse Anti-Human CD64-PE溶液(Cat:12-0649；美國eBioscience公司)、Mouse Anti-Human CD3-PE-CF594溶液(Cat:562280；美國BD Bioscience公司)；Mouse Anti-Human Anti-Human CD19-PE-CY5溶液(Cat:A07771；美國Beckman Coulter公司)、Mouse Anti-human CD272-PE溶液(BTLA)(Cat:344506；美國Biolegend公司) OptiLyse C紅細胞裂解液(11895；美國Beckman Coulter公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone SH30256.01B；北京Therm公司)。FC500 MPL流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.3方法 患兒入院24 h內(nèi)，在取得家屬同意的前提下，采集清晨空腹外周靜脈血送至相關化驗室檢測并報告結果；另外留取1.5 mL在乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(紫頭)中自行實驗通過流式細胞儀測得。

取EDTA 抗凝管中的全血20 μL依次置于分別標記A、B的流式管中；在暗光下依次向流式管中加入單克隆抗體染色劑各1.5 μL(A管：CD64-PE、CD45-PE-CY5，B管：CD3-CF594、CD19-PE-CY5、CD272-PE)，混勻避光20 min后分別加入1×紅細胞裂解液1 500 μL，再混勻避光20 min后以1 500 r/min離心5 min，共2次；最后加1×PBS 700 μL混勻，至此熒光抗體標記樣本制備好，并用流式細胞儀檢測；所得結果使用FlowJo_V10軟件分析，計算中性粒細胞平均熒光強度和淋巴細胞平均熒光強度得出CD64指數(shù)，計算B淋巴細胞的百分比及其BTLA表達。

2 結 果

2.1中性粒細胞指數(shù)變化 N代表中性粒細胞平均熒光強度；L代表淋巴細胞平均熒光強度，CD64指數(shù)表示N的MFI與L的MFI比值。根據(jù)統(tǒng)計分析結果可知，感染組和哮喘組中性粒細胞CD64指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 中性粒細胞CD64表達

圖2 B淋巴細胞百分率及BTLA表達

2.2B細胞的百分比及其BTLA的表達 根據(jù)統(tǒng)計分析結果可知，哮喘組B淋巴細胞百分比高于感染組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；哮喘組B淋巴細胞表面BTLA表達(百分比及平均熒光強度)較感染組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖3 B淋巴細胞與其表達BTLA相關性

2.3B細胞與其表達的BTLA相關性分析 根據(jù)統(tǒng)計分析結果可知，哮喘組B淋巴細胞百分比與其表達BTLA呈正相關(r=0.569 8，P=0.002 4<0.01)，見圖3。

圖4 血清CRP水平

圖5 血清IgE水平

2.4外周血清CRP與IgE分析 根據(jù)統(tǒng)計分析結果可知，哮喘組血清CRP水平較感染組低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4；感染組血清IgE水平較哮喘組有顯著減低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖5。

3 討 論

兒童哮喘的發(fā)生并無特定、明確的病因，該病是由遺傳因素與環(huán)境因素共同導致。對于多數(shù)哮喘患兒，追尋病史可發(fā)現(xiàn)其三代近親屬中有人罹患哮喘。除哮喘外，還可以發(fā)現(xiàn)患兒家族近親中有過敏性鼻炎、蕁麻疹、濕疹等患者。且該病具有多基因遺傳傾向，并非獨立發(fā)病，感染、塵螨、空氣污染、花粉過敏、食物過敏、運動、情緒變化等均可引發(fā)哮喘。越來越多的研究證明，病毒、細菌及定植菌在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮了一定的作用，它們可能作為獨立影響因素，或者病毒的輔因子[4-7]。BISGAARD等[6]通過大的出生隊列研究發(fā)現(xiàn)哮喘母親分娩的無癥狀新生兒在生后5年內(nèi)發(fā)生哮喘與其咽部定植肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌呈正相關。對同一人群進行第二項研究，觀察發(fā)生喘息性疾病時細菌和病毒在呼吸道出現(xiàn)的頻率[8]。他們發(fā)現(xiàn)，喘息與細菌感染(肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌)密切相關，這種關系與病毒感染相似但又有區(qū)別。本研究結果顯示，感染組CRP高于哮喘組，哮喘患兒在急性發(fā)作期可合并有細菌感染，感染不是哮喘的獨立發(fā)病因素，除外遺傳背景，還可能與過敏、運動、情緒變化等有關。另外本研究顯示，感染組CD64指數(shù)低于哮喘組，這與預期結果不符。中性粒細胞作為固有免疫的重要細胞，在細菌侵入機體后第一時間到達炎癥部位，通過吞噬病原體、分泌抗菌物質(zhì)發(fā)揮作用，同時分泌細胞因子募集單核巨噬細胞、樹突狀細胞等發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。國外學者認為CRP和CD64均可作為細菌感染的檢測指標，CD64在感染12 h內(nèi)一般即有變化，而CRP出現(xiàn)變化較晚，一般超過24 h[9]。在正常情況時，中性粒細胞表面很少表達CD64，而當機體感染細菌后，中性粒細胞表面的CD64表達明顯增多。在一般細菌感染，固有免疫發(fā)揮重要作用。故預期結果與實驗結果相反。哮喘被認為是一類變態(tài)反應性疾病，CD64在哮喘患兒中性粒細胞表面的過度表達可能與機體粒細胞吞噬、活化反應降低有關[10-11]。感染作為哮喘發(fā)病的危險因素，不僅加重已有的哮喘，而且促進哮喘的發(fā)生、發(fā)展，使其難以控制。所以，本研究認為在哮喘患者在有CD64或CRP指標異常情況下需積極抗感染治療。另外，本課題組之前的研究顯示，對于細菌感染聯(lián)合檢測CD64和CRP的靈敏度及準確度均較單一指標升高[12]。

哮喘發(fā)病是多種因素相互作用的結果，免疫因素所致的氣道慢性炎癥被認為是哮喘的本質(zhì)，除外固有免疫應答，適應性免疫應答也參與哮喘的發(fā)病。免疫功能紊亂與哮喘的發(fā)生、發(fā)展密切相關。正常情況下，淋巴細胞亞群的比例在一定范圍內(nèi)。在適應性免疫應答中，T細胞的完全活化需要TCR-CD3特異性識別pMHC產(chǎn)生的第一活化信號、T細胞與APC表面的共刺激分子相互作用后產(chǎn)生第二活化信號及Th細胞上調(diào)表達相關細胞因子受體結合細胞因子產(chǎn)生的第三信號。B細胞在適應性免疫應答中也起重要作用。對絕大部分B 細胞來說，其活化需要T細胞輔助，完全活化需要先B-T結合提供第一信號、然后B 細胞表面共刺激分子傳遞第二信號、最后B細胞表達細胞因子受體結合細胞因子傳遞第三信號。大部分B 細胞活化后，轉化為漿細胞，產(chǎn)生大量 IgE，IgE的合成增多是兒童哮喘的主要免疫特性。本實驗結果顯示：哮喘組B淋巴細胞百分比及IgE水平較感染組明顯升高，證實B淋巴細胞參與了哮喘的發(fā)病，并發(fā)揮了重要作用。故認為臨床上檢測B淋巴細胞及IgE水平有助于哮喘的診治，可提早預防。

BTLA是CD28家族抑制性受體成員之一，是表達在細胞膜表面的1型跨膜蛋白，包含一個免疫球蛋白超家族結構域，一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)域，后者包含一個近端免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)和遠端的免疫受體酪氨酸轉換基序(ITSM)。BTLA最初是從鼠Th1細胞中克隆而來。目前發(fā)現(xiàn)BTLA廣泛表達于B淋巴細胞、T淋巴細胞(CD4+T細胞/CD8+T細胞/調(diào)節(jié)性T細胞)、巨噬細胞、樹突狀細胞和NK細胞等。HVEM是BTLA的唯一配體，為腫瘤壞死因子受體超家族的一個成員，與BTLA相互作用參與免疫耐受。BTLA是B和T淋巴細胞的共抑制受體，在炎癥和感染過程中調(diào)節(jié)淋巴細胞活化發(fā)揮重要作用。研究更多的是其在T淋巴細胞的作用。已知BTLA抑制小鼠和人類T細胞的活化和增殖。然而關于BTLA在B淋巴細胞中的作用和功能的研究甚少。VENDEL等[13]研究了B細胞BTLA的抑制作用。BTLA與HVEM結合后抑制B細胞的增殖，主要是通過減少脾酪氨酸激酶(SYK)、B細胞連接蛋白和磷脂酶C-γ2的磷酸化下調(diào)BCR下游信號分子的信號強度發(fā)揮作用。THIBULT等[14]認為，BTLA/HVEM信號通路可以通過抑制CG二核苷酸來抑制B細胞的功能。動物實驗顯示特異性抗體反應和自身免疫性肝炎與BTLA缺乏有關，突出BTLA在調(diào)節(jié)B細胞的自身免疫性方面的潛在作用。有數(shù)據(jù)顯示缺乏BTLA能夠促進受細菌感染誘導的抗原特異性CD8+T細胞的存活，再次表明BTLA可能在維持免疫系統(tǒng)的平衡方面起作用。雖然BTLA被普遍看作是一個共抑制受體，但是有報告認為這可能取決于抗原刺激的強度。研究顯示，免疫衰老時B淋巴細胞表達BTLA減少，這可能與老年人長壽血漿細胞、記憶B細胞和抗體效價誘導減低有關。由此推測BTLA可能促進而不是抑制長壽漿細胞和記憶B細胞的誘導，當然這有待于進一步研究。本研究中哮喘組BTLA表達水平較感染組低。此外，B淋巴細胞百分比與其BTLA的表達呈正相關。結合本研究中哮喘組B淋巴細胞表達較感染組多，筆者猜測可能處在不同分化階段的BTLA表達水平不同。THIBULT等[14]研究表明，處在不同階段的B淋巴細胞其BTLA的表達水平也有變化。雖然BTLA在所有B淋巴細胞亞群表達，但是在初始B淋巴細胞(CD19+IgD+CD27-)和記憶B淋巴細胞(CD19+IgD-CD27+)的表達明顯低于IgM記憶B淋巴細胞(CD19+IgD+CD27+)，循環(huán)過渡期B淋巴細胞(CD27-IgD+CD24high和CD38high)表達更高。研究還分析了HVEM在B淋巴細胞分化亞群的表達；與BTLA相反，HVEM的表達與B淋巴細胞所處分化階段無關。研究還分析了B淋巴細胞活化時BTLA的變化情況。B淋巴細胞表達基因編碼的TLAR(Toll樣受體)，主要與先天性免疫有關，然后針對入侵的病原體發(fā)生適應性免疫應答。人體TLR9的表達則只存在于B淋巴細胞、漿細胞樣樹突狀細胞。TLR9識別低甲基化CpG基序(細菌、病毒和原生動物DNA的特征)，后者與人工合成的寡聚核苷酸相似(如CpG基序)。研究中，接種含CpG佐劑疫苗的黑色素瘤患者循環(huán)B淋巴細胞持續(xù)表達BTLA，而接種缺乏CpG佐劑疫苗的黑色素瘤患者循環(huán)中B淋巴細胞BTLA表達逐步下調(diào)。在B淋巴細胞分化過程中，BTLA表達被調(diào)節(jié)，在IgM記憶B淋巴細胞BTLA表達升高。結合上述內(nèi)容，雖然哮喘組B淋巴細胞百分比較感染組高，但BTLA表達較感染組低，筆者推測一方面與B淋巴細胞分化所處階段有關，另一方面與細菌感染人體后其低甲基化CpG基序被B細胞表面TLR9識別，使B淋巴細胞持續(xù)表達BTLA。

本研究的不足之處：因患兒年齡較小、入組標準嚴格、采集血液標本需征求家屬知情同意，故最終入組對象數(shù)量相對較少，一定程度上可能影響試驗結果，其樣本代表性還需進一步的試驗驗證。

綜上所述，筆者認為感染是哮喘發(fā)病的重要誘因，臨床上哮喘患者有感染應積極抗感染治療。哮喘發(fā)病機制復雜，BTLA、B淋巴細胞、IgE等只是其眾多研究中的一部分。哮喘發(fā)病眾多因素相互影響、相互作用，構成了一個巨大的網(wǎng)絡，需要更大樣本量、更加系統(tǒng)、多中心的臨床研究來闡釋其中錯綜復雜的網(wǎng)絡關系機制。