GAPDH降解途徑在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷中的作用

陳春暖，陳祥榮，蔡乾昆，葉勵(lì)超，蔡若蔚，萬(wàn)瓊紅，王濤

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2神經(jīng)外科，泉州362000；3華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢430020）

帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）是一種中老年人群常見(jiàn)的慢性神經(jīng)退行性疾病，其主要病理特征為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性變性缺失和路易小體形成。目前其病因和發(fā)表機(jī)制尚未完全闡明。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為PD是由遺傳易感性、年齡老化及環(huán)境因素等多因素共同作用的結(jié)果。近年來(lái)研究認(rèn)為蛋白質(zhì)降解障礙是導(dǎo)致PD發(fā)生的重要機(jī)制之一。

3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種在能量代謝中起重要作用的經(jīng)典糖酵解酶蛋白。GAPDH最初被認(rèn)為是一個(gè)參與糖酵解過(guò)程的簡(jiǎn)單管家基因和內(nèi)參蛋白，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)GAPDH并非一個(gè)功能單一的蛋白質(zhì)，除糖酵解作用外，還參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，如膜融合和轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA修復(fù)、核RNA輸出、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)平衡、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生等[1,2]。GAPDH 與神經(jīng)變性疾病相關(guān)蛋白，如α-突觸核蛋白（α-synuclein）、β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，β-APP）和亨廷頓蛋白（huntingtin）等有相互作用，參與多種因素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。越來(lái)越多證據(jù)表明GAPDH與PD等神經(jīng)變性疾病具有密切關(guān)系[1,2]。

細(xì)胞內(nèi)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）和自噬-溶酶體途徑（autophagy-lysosome pathway，ALP）是蛋白降解的兩個(gè)主要途徑，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解。UPS參與細(xì)胞增殖分化、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞黏附及細(xì)胞凋亡等生命過(guò)程[3]。ALP作為細(xì)胞內(nèi)另一種重要的蛋白降解途徑，負(fù)責(zé)UPS未能降解的錯(cuò)誤折疊蛋白等大分子物質(zhì)的降解，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及細(xì)胞重塑等生理過(guò)程[4]。兩者共同在細(xì)胞新陳代謝中發(fā)揮非常重要的作用。蛋白降解途徑功能受損可導(dǎo)致蛋白清除障礙使得蛋白在細(xì)胞內(nèi)積聚，這兩條途徑功能障礙都可能導(dǎo)致神經(jīng)變性和細(xì)胞死亡，與PD的發(fā)生存在密切關(guān)系[5]。

魚(yú)藤酮（rotenone）是一種常用的魚(yú)塘清理劑和殺蟲(chóng)劑，是廣泛存在于自然界的環(huán)境毒素，與我們的生活密切相關(guān)且容易接觸。它通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ活性，抑制線粒體呼吸鏈對(duì)氧的利用，使細(xì)胞缺氧而發(fā)揮毒性作用。作為一種新型的造模工具藥，目前廣受關(guān)注。線粒體功能障礙也是PD發(fā)病的重要機(jī)制之一，我們選取魚(yú)藤酮誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞SH-SY5Y建立PD細(xì)胞模型，能夠很好地模擬PD的發(fā)病機(jī)制[6]。本研究在模型中觀察細(xì)胞內(nèi)GAPDH表達(dá)變化，并分別加入蛋白酶體和自噬抑制劑及激活劑處理細(xì)胞，研究?jī)煞N蛋白降解途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)GAPDH降解的作用。

材料和方法

1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心；DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；魚(yú)藤酮、二甲基亞砜（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）、蛋白酶體抑制劑MG132、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）及自噬激活劑雷帕霉素（rapamycin）為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；鼠抗GAPDH購(gòu)自Millipore公司；鼠抗β-actin購(gòu)自武漢三鷹公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒等購(gòu)自碧云天公司；SDS-PAGE制膠試劑盒購(gòu)自谷歌生物公司。魚(yú)藤酮、MG132和rapamycin用DMSO作為溶劑配制儲(chǔ)存液，MG132和rapamycin儲(chǔ)存液濃度分別為20mg/ml和100μmol/L。3-MA溶于水，儲(chǔ)存液濃度為100mmol/L。蛋白酶體激活劑氯化鎂（MgCl2）儲(chǔ)存液用PBS配制，儲(chǔ)存液濃度為0.5g/ml。

2 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理及分組

SH-SY5Y細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基〔其內(nèi)含10%（體積分?jǐn)?shù)）滅活胎牛血清，青霉素、鏈霉素終濃度均為100U/L〕培養(yǎng)。使用1μmol/L魚(yú)藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞24h建立PD細(xì)胞模型[6]。實(shí)驗(yàn)分為6組,包括正常對(duì)照組（Con）、魚(yú)藤酮處理組（Rot）、魚(yú)藤酮+蛋白酶體抑制劑組（Rot+MG132）、魚(yú)藤酮+蛋白酶體激活劑組（Rot+MgCl2）、魚(yú)藤酮+自噬抑制劑組（Rot+3-MA）和魚(yú)藤酮+自噬激活劑組（Rot+Rap），處理時(shí)間為24h。

3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力及選取藥物濃度

調(diào)節(jié)SH-SY5Y細(xì)胞密度，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積200μl。細(xì)胞貼壁后，加入不同終濃度的MG132、3-MA、rapamycin和MgCl2，并設(shè)空白組、溶劑對(duì)照組及正常對(duì)照組，孵育24h，每組設(shè)五個(gè)平行孔。觀察形態(tài)之后，每孔加入 MTT 溶液（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4～6h，棄除培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μl，振蕩10min，使甲臜充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔在490nm波長(zhǎng)處的OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=藥物組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取以下有效藥物濃度：MG132 5mmol/L、MgCl250mmol/L、Rapamycin 0.2μmol/L、3-MA 10mmol/L。再根據(jù)本實(shí)驗(yàn)分組Con組、Rot組、Rot+MG132組、Rot+MgCl2組、Rot+3-MA組和Rot+Rap組，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，更換為含有終濃度為1μmol/魚(yú)藤酮及上述終濃度相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，觀察細(xì)胞形態(tài)，行MTT檢測(cè)。

4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞GAPDH蛋白表達(dá)

細(xì)胞于5 mL培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組更換為相應(yīng)藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h后，觀察細(xì)胞形態(tài)后，用RIPA裂解液分別提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%（50 g/L）脫脂奶粉封閉2h。封膜，加入鼠抗GAPDH抗體（1∶1000）或鼠抗β-actin抗體（1∶2000）4℃過(guò)夜。清洗后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（1∶5000）室溫孵育2h，洗膜后用ECL曝光、顯影。根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量（GAPDH：37000；β-actin：43000）確定目的條帶位置，用圖像分析軟件分析條帶光密度。以β-actin為內(nèi)參蛋白，將兩者光密度比值（GAPDH/β-actin）作為GAPDH蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以空白對(duì)照組相對(duì)表達(dá)量為1，觀察各組GAPDH的表達(dá)情況。上述實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。各實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞存活率及GAPDH相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 激活蛋白酶體和自噬通路減輕魚(yú)藤酮細(xì)胞毒性

顯微鏡觀察顯示，無(wú)藥物處理的正常對(duì)照組SHSY5Y細(xì)胞24h時(shí)生長(zhǎng)較密，突起明顯且細(xì)長(zhǎng)，輕搖晃培養(yǎng)基細(xì)胞不易脫落，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。各藥物處理組細(xì)胞在24h時(shí)生長(zhǎng)部分抑制：魚(yú)藤酮1μmol/L組細(xì)胞突起變短和減少，胞體稍腫脹，細(xì)胞部分圓縮；魚(yú)藤酮加5mmol/L MG132和魚(yú)藤酮加10mmol/L 3-MA處理的細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制更明顯，其中Rot+3-MA組漂浮、圓縮細(xì)胞更多；Rot+Rap（0.2μmol/L）和Rot+MgCl2（50mmol/L）細(xì)胞突起明顯細(xì)長(zhǎng)，腫脹及圓縮細(xì)胞較單獨(dú)魚(yú)藤酮組少（圖1）。

圖1 蛋白酶體和自噬通路活性對(duì)魚(yú)藤酮細(xì)胞形態(tài)毒性的影響。比例尺，100μmFig. 1 Effects of proteasome and autophagy pathway activities on the morphology of rotenone induced SH-SY5Y cells. Scale bar, 100μm

MTT法檢測(cè)顯示，魚(yú)藤酮、魚(yú)藤酮+MG132、魚(yú)藤酮+3-MA、魚(yú)藤酮+rapamycin和魚(yú)藤酮+MgCl2處理的SH-SY5Y細(xì)胞活性明顯下降，其中以Rot+3-MA組抑制細(xì)胞活性更明顯（圖2A）。雖然各藥物對(duì)魚(yú)藤酮處理細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響（圖2A），但各藥物單獨(dú)處理SH-SY5Y細(xì)胞24h發(fā)現(xiàn)，魚(yú)藤酮、MG132和3-MA均明顯抑制細(xì)胞活性，而rapamycin和MgCl2對(duì)細(xì)胞活性幾乎沒(méi)有影響（圖2B）。

2 激活蛋白酶體和自噬通路抑制魚(yú)藤酮對(duì)GAPDH水平的上調(diào)

Western blot檢測(cè)表明，魚(yú)藤酮處理后細(xì)胞內(nèi)GAPDH蛋白水平上調(diào)，加入蛋白酶體抑制劑MG132和自噬溶酶體途徑抑制劑3-MA后細(xì)胞內(nèi)GAPDH上升更明顯，加入蛋白酶體促進(jìn)劑MgCl2和溶酶體途徑激活劑rapamycin均可抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的GAPDH水平上調(diào)，以MgCl2的抑制作用更為明顯，而rapamycin的抑制作用與單獨(dú)魚(yú)藤酮處理組、正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異（圖3）。

圖2 蛋白酶體和自噬通路活性對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響。*與正常對(duì)照組比較，0.01＜P＜0.05；#與魚(yú)藤酮組比較，0.01＜P＜0.05Fig. 2 Effects of proteasome and autophagy pathway activities on the viability of SH-SY5Y cells. *, 0.01＜P＜0.05, compared with normal control group;#, 0.01＜P＜0.05, compared with rotenone group

圖3 魚(yú)藤酮及蛋白酶體和自噬活性對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞GAPDH水平影響的Western blot檢測(cè)。A，代表性Western blot；B，魚(yú)藤酮及蛋白酶體和自噬活性對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞GAPDH水平影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*與正常對(duì)照組比較，0.01＜ P ＜0.05；#與單獨(dú)魚(yú)藤酮處理組比較，0.01＜P＜0.05Fig. 3 Western blot analysis on the effects of rotenone as well as proteasome and autophagy pathway activities on the levels of GAPDH in SHSY5Y cells. A, representative Western blot; B, statistical analysis on the effects of rotenone and proteasome and autophagy pathway activities on GAPDH levels; *, 0.01＜P＜0.05 vs normal control; #, 0.01＜P＜0.05 vs rotenone treatment

討 論

在PD中發(fā)現(xiàn)存在著UPS和ALP這兩條降解通路功能的異常[7-9]。多種因素如環(huán)境毒素暴露、基因突變等，均可誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)蛋白過(guò)表達(dá)和異常聚集，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)這些蛋白超過(guò)了自身清除能力或由于蛋白清除系統(tǒng)功能障礙，都必將加重功能異常蛋白質(zhì)聚集，導(dǎo)致包涵體形成，對(duì)神經(jīng)元造成損傷并最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。蛋白異常聚集不僅是包涵體形成的重要分子基礎(chǔ)，并可能與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等密切相關(guān)，也是PD發(fā)病的重要分子機(jī)制。本課題組采用魚(yú)藤酮建立PD細(xì)胞模型，在模型中也發(fā)現(xiàn)蛋白的過(guò)表達(dá)及異常聚集，能夠很好地模擬PD的發(fā)病機(jī)制，具有可靠性[6,10]。

本研究中，我們選擇目前較為公認(rèn)的蛋白酶體抑制劑MG132和促進(jìn)劑Mg2+、自噬抑制劑3-MA和激活劑rapamycin[5,11]，其中Mg2+是參與UPS泛素化修飾的重要分子，可增加E1泛素活化酶、E2泛素結(jié)合酶和E3泛素連接酶的酶活性，從而促進(jìn)蛋白降解。從細(xì)胞形態(tài)來(lái)看，正常對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)較密，神經(jīng)突起明顯且細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞貼壁能力強(qiáng)。各藥物處理組細(xì)胞生長(zhǎng)均不同程度受抑制，單獨(dú)魚(yú)藤酮組細(xì)胞突起變短、減少，胞體稍腫脹，細(xì)胞部分圓縮；加入蛋白酶體和自噬途徑抑制劑后細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制更明顯，其中自噬途徑抑制劑組漂浮、圓縮細(xì)胞更多；而加入蛋白酶體和自噬途徑激活劑后細(xì)胞突起細(xì)長(zhǎng)，腫脹及圓縮細(xì)胞較單獨(dú)魚(yú)藤酮組少；MTT結(jié)果也顯示藥物處理組細(xì)胞活性受抑制，其中自噬途徑抑制劑組抑制細(xì)胞活性最明顯。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中存在GAPDH的過(guò)表達(dá)[10,12]。本實(shí)驗(yàn)主要探討?hù)~(yú)藤酮誘導(dǎo)后GAPDH在細(xì)胞內(nèi)的降解途徑。在魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型中，加入蛋白酶體和自噬溶酶體途徑抑制劑和激活劑，觀察UPS和ALP這兩個(gè)降解通路與GAPDH降解的關(guān)系。結(jié)果顯示，魚(yú)藤酮誘導(dǎo)GAPDH過(guò)表達(dá)，加入蛋白酶體抑制劑MG132和自噬抑制劑3-MA后細(xì)胞內(nèi)GAPDH上升更明顯，說(shuō)明兩種降解途徑抑制劑均抑制了GAPDH的降解，而蛋白酶體途徑抑制劑作用更明顯；加入蛋白酶體促進(jìn)劑Mg2+和自噬激活劑rapamycin后魚(yú)藤酮對(duì)細(xì)胞GAPDH水平的上調(diào)作用被明顯抑制，且以Mg2+的作用更明顯，說(shuō)明兩種途徑的激活劑均可促進(jìn)GAPDH的降解，而以蛋白酶體途徑更明顯。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，UPS和ALP兩種途徑都參與GAPDH的降解，加入U(xiǎn)PS途徑抑制劑和激活劑GAPDH的變化較ALP途徑稍明顯，推測(cè)UPS可能在GAPDH降解中發(fā)揮更重要的作用。

UPS和ALP功能異?？蓪?dǎo)致蛋白質(zhì)清除障礙和異常聚集[13,14]。PD遺傳學(xué)研究顯示parkin（一種E3泛素連接酶）和UCH-L1基因突變可導(dǎo)致家族性PD發(fā)生，這兩種基因編碼蛋白都參與泛素依賴(lài)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解[5,15]。在路易小體中發(fā)現(xiàn)蛋白酶體亞單位，也進(jìn)一步說(shuō)明UPS損害與PD的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[16]。帕金森病相關(guān)蛋白PINK1參與聚集體形成過(guò)程中既有泛素化因素也有自噬因素，也說(shuō)明兩條途徑在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用[17]。α-突觸核蛋白（α-synuclein）是路易小體的重要組分，與PD發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。使用蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)UPS損害可以導(dǎo)致α-突觸核蛋白聚集，促進(jìn)包涵體形成和增加細(xì)胞死亡[15,18]。另外，自噬也是細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白和受損細(xì)胞器的主要降解方式，通過(guò)形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，通過(guò)溶酶體酶降解其內(nèi)容物[19]。研究顯示聚集傾向的蛋白也可通過(guò)自噬途徑降解[20]。α-突觸核蛋白就是一個(gè)例子，它不僅通過(guò)UPS降解，也通過(guò)ALP降解[21]，通過(guò)調(diào)控UPS和ALP進(jìn)而促進(jìn)易聚集蛋白的清除可能成為延緩PD疾病進(jìn)展的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及我們的研究結(jié)果，GAPDH也是一個(gè)聚集傾向的蛋白，它與α-突觸核蛋白的關(guān)系密切，共同參與路易小體形成[1]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GAPDH與α-突觸核蛋白一樣，可能都通過(guò)UPS和ALP兩條途徑降解，也進(jìn)一步證實(shí)這兩條蛋白降解途徑在PD發(fā)病機(jī)制中的重要作用。