慢病毒介導(dǎo)IGF—1基因修飾肌源性干細(xì)胞移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

陳春經(jīng)

【摘要】 目的：探討IGF-1基因修飾的肌源性干細(xì)胞（MDSCs）移植治療雌性壓力性尿失禁大鼠的作用及可能機(jī)制。方法：尿失禁大鼠隨機(jī)分對(duì)照組即MDSCs移植組（n=15）和治療組即IGF-1基因修飾的MDSCs移植組（n=15），以1×106個(gè)MDSCs/只注入尿道距膀胱約0.5 cm處，評(píng)價(jià)注射后尿道閉合功能情況、VEGF的表達(dá)情況及移植細(xì)胞存活情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，治療組膀胱最大容量及腹壓漏尿點(diǎn)壓（ALPP）均升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；細(xì)胞存活數(shù)、VEGF蛋白表達(dá)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：IGF-1基因修飾的MDSCs增強(qiáng)了其在移植環(huán)境中的生存能力，并通過(guò)其旁分泌功能，可能為治療壓力性尿失禁提供了一種新的方法。

【關(guān)鍵詞】：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1； 肌源性干細(xì)胞； 壓力性尿失禁； 生存能力

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.14.073 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2018）14-0-03

Therapeutic Efficacy of Lentiviral Vector Mediated IGF-1 Gene-Modified Muscle-Derived Stem Cells in Rats with Female Stress Urinary Incontinence/CHEN Chunjing.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（14）：170-172

【Abstract】 Objective：To explore that whether muscle-derived stem cells（MDSCs） pretreated with IGF-1 could promote urethral sphincter restoration in pudendal nerve-transected rat model.Method：Rats with Female Stress Urinary Incontinence were randomly divided into IGF-1/MDSCs injection group（the experimental group，n=15） and MDSCs injection group（the control group，n=15）.MDSCs survival，urethral resistance function，western blot were carried out.Result：Compared with the control group，the maximum capacity of the bladder and abdominal leak point pressure（ALPP） were all increased（P>0.05），and the number of cells survival and expression of VEGF protein were increased significantly in the experimental group（P<0.05）.Conclusion：MDSCs pretreated with IGF-1 that enhance their viability in the transplant environment and through their paracrine function may provide a new way to treat stress urinary incontinence.

【Key words】 IGF-1； Muscle-derived stem cell； Stress urinary incontinence； Viability

First-authors address：Sanming First Hospital Affiliated to Fujian Medical University，Sanming 365000，China

全球約有2億多尿失禁患者，其中女性是男性的2～3倍，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。且隨著年齡的增長(zhǎng)，發(fā)病率顯著上升，其中壓力性尿失禁（stress urinary incontinence，SUI）是最常見(jiàn)的類(lèi)型[1]。其發(fā)病機(jī)制主要包括尿道高活動(dòng)性和尿道固有括約肌功能障礙（intrinsic sphincter deficiency，ISD）[2]。老年女性SUI患者，幾乎均合并存在ISD[3]，現(xiàn)有的治療方法尚不能完全解決伴有ISD的SUI患者的尿道括約肌閉合功能問(wèn)題。因此，迫切需要從本質(zhì)上尋求一種方法以改善尿道括約肌結(jié)構(gòu)和功能缺陷。肌源性干細(xì)胞移植可以修復(fù)和改善骨骼肌功能[4-5]，尿道橫紋肌與骨骼肌同源，因此，肌源性干細(xì)胞移植也成為伴有ISD的SUI的一個(gè)研究熱點(diǎn)。而隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體局部缺血缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素均可導(dǎo)致植入的干細(xì)胞存活率下降，進(jìn)而影響細(xì)胞移植的治療效果，因此，如何改善移植微環(huán)境、促進(jìn)移植干細(xì)胞的存活，是首要解決的問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)合外源性生長(zhǎng)因子如FGF、HGF、PDGF等可以改善移植微環(huán)境，有利于植入到體內(nèi)干細(xì)胞的定植、生長(zhǎng)和分化[6]。簽于此，本研究探討IGF-1基因修飾的MDSCs移植治療雌性SUI大鼠的作用及可能機(jī)制，旨在尋求一種最佳治療SUI的方案。

1 材料與方法

1.1 主要材料

取近交系健康未孕雌性Wistar大鼠30只，3～4周齡，級(jí)別為SPF級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（滬）。隨機(jī)分為兩組：MDSCs組（對(duì)照組）和IGF1/MDSCs組（治療組），每組15只，其次每組按術(shù)后1周、2周、4周再均分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組5只。激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zeiss，LCSM510），尿動(dòng)力儀（加拿大Labrie）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠SUI模型建立 以雙側(cè)陰部神經(jīng)切斷（Pudendal Nerve-Transected，PNT）的方法[7]，制備大鼠SUI模型。（1）麻醉、固定、備皮、術(shù)區(qū)消毒；（2）取背側(cè)縱形切口，手術(shù)顯微鏡下找到相對(duì)粗大的坐骨神經(jīng)；（3）沿坐骨神經(jīng)走行，在其進(jìn)入閉孔發(fā)出分叉處找到陰部神經(jīng)；（4）切斷雙側(cè)陰部神經(jīng)約2 mm；（5）縫合切口；（6）備行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MDSCs注射治療SUI大鼠模型 各組在距膀胱約0.5 cm處尿道近端的3、9點(diǎn)處進(jìn)針注射含有約1×106個(gè)MDSCs和IGF1/MDSCs懸液，使局部隆起，注射細(xì)胞后留針約10 s，后緩慢出針。

1.2.3 尿動(dòng)力學(xué)檢查注射后各組大鼠尿控功能 所有大鼠分別于注射后1、2、4周行最大膀胱容量及腹壓漏尿點(diǎn)壓（Abdominal Leak Point Pressure，ALPP）檢測(cè)。（1）行尿動(dòng)力學(xué)檢查前的準(zhǔn)備工作；（2）麻醉、固定、暴露膀胱，于膀胱頂部做荷包縫合，荷包中央植入軟質(zhì)硬膜外麻醉導(dǎo)管，另端經(jīng)皮下隧道固定于大鼠頸背部；（3）檢測(cè)時(shí)于頸部導(dǎo)管埋藏處將導(dǎo)管挑出，插入一號(hào)注射針頭，經(jīng)三通管分別連接灌注泵和壓力傳感器；（4）人工排空膀胱并校零后，以5 ml/h的速度灌注含美蘭的無(wú)菌生理鹽水觀察膀胱壓力上升情況；一旦尿道口有藍(lán)色液體溢出，停止灌注，記錄此時(shí)膀胱容量即最大膀胱容量。人工排空膀胱并校零后，以同樣速度灌注達(dá)膀胱容量的一半，緩慢地按壓腹部直到出現(xiàn)漏尿，此時(shí)的膀胱峰壓即為ALPP，測(cè)定三次，取平均值。

1.2.4 多重免疫熒光化學(xué)染色 細(xì)胞注射治療后1周行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后分別處死各組動(dòng)物，觀察各組細(xì)胞在組織內(nèi)的存活情況。（1）斷頸法處死大鼠，暴露尿道；（2）剪取注射部位約0.5 cm長(zhǎng)度的近端尿道，加入O.C.T冷凍包埋劑，置-80 ℃超低溫冰箱保存；（3）將O.C.T包埋組織使用恒溫冰凍切片機(jī)制成厚約8 μm的冰凍切片；（4）冰丙酮固定10 min后凍存于-20 ℃低溫冰箱，用于多重免疫熒光染色；（5）對(duì)收集的標(biāo)本取三片非連續(xù)的8 μm薄片進(jìn)行多重免疫熒光化學(xué)檢測(cè)，每張切片在移植細(xì)胞分布區(qū)隨機(jī)取5個(gè)視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野移植細(xì)胞數(shù)（個(gè)/HP），取其平均值作為該標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)。

1.2.5 Western-blot分析VEGF蛋白的表達(dá) 細(xì)胞注射治療后4周行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)后分別處死各組動(dòng)物，觀察各組VEGF蛋白的表達(dá)情況。取0.5 cm注射部位近端尿道，通過(guò)細(xì)胞收集，蛋白提取及測(cè)定，電泳分離，免疫印跡（濕轉(zhuǎn)），免疫顯色，圖像分析，灰度值計(jì)算，以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1基因修飾MDSCs對(duì)大鼠SUI模型尿動(dòng)力學(xué)的影響

與對(duì)照組（MDSCs組）比較，治療組（IGF1/MDSCs組）在治療1、2、4周后，膀胱最大容量和ALPP均升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1、表2。

2.2 兩組細(xì)胞存活情況

在細(xì)胞注射治療1周后，與對(duì)照組（MDSCs組）細(xì)胞存活數(shù)（87.67±1.53）個(gè)/每個(gè)高倍鏡視野比較，治療組（IGF1/MDSCs組）的細(xì)胞存活數(shù)（107.67±2.52）個(gè)/每個(gè)高倍鏡視野顯著高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.3 兩組大鼠近端尿道組織VEGF蛋白表達(dá)

在細(xì)胞注射治療4周后，與對(duì)照組VEGF蛋白的表達(dá)（0.69±0.02）比較，治療組（0.80±0.03）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

注：A圖為治療組細(xì)胞存活情況（×200），B組為對(duì)照組細(xì)胞存活情況（×200）。

3 討論

現(xiàn)有的治療對(duì)伴有ISD的SUI患者充滿(mǎn)挑戰(zhàn)，細(xì)胞治療為之提供了一個(gè)可能。研究發(fā)現(xiàn)MDSCs不經(jīng)誘導(dǎo)可以分化為肌細(xì)胞，已成功應(yīng)用于臨床治療SUI[8]。然而，植入的MDSCs由于機(jī)體局部缺血缺氧、氧化應(yīng)激等不利因素致使植入的細(xì)胞存活率下降，進(jìn)而影響細(xì)胞的移植效果?；蛐揎椀募?xì)胞治療可以通過(guò)優(yōu)化移植細(xì)胞微環(huán)境，提高細(xì)胞的活性，進(jìn)而改善細(xì)胞的移植效果[9]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植治療1周后，IGF1/MDSC組細(xì)胞在尿道注射部位分布比較集中，存活率顯著高于MDSC組。提示IGF-1作為一促存活因子，可以?xún)?yōu)化移植微環(huán)境，提高植入MDSCs的存活率，進(jìn)而促進(jìn)MDSCs分化為成肌細(xì)胞，改善尿道括約肌閉合功能[10]。

骨骼肌損傷后的再生修復(fù)還應(yīng)考慮局部血管的再生化。廣泛的血管網(wǎng)可以促進(jìn)局部血液循環(huán)，利于植入細(xì)胞的生存生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞治療4周后，IGF1/MDSC組尿道局部VEGF蛋白表達(dá)量明顯高于MDSC組。提示IGF-1可以促進(jìn)MDSCs分泌VEGF，而VEGF具有促進(jìn)肌細(xì)胞生成及促進(jìn)血管再生的雙重作用，進(jìn)而改善尿道括約肌閉合功能[11]。

在應(yīng)力狀態(tài)下，具有神經(jīng)支配的尿道括約肌的收縮功能變化可以通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)中ALPP反映[12]，研究發(fā)現(xiàn)IGF1/MDSC組在治療1、2、4周后ALPP均高于MDSC組，提示IGF-1可能促進(jìn)尿道固有括約肌神經(jīng)再支配，進(jìn)而進(jìn)一步改善尿道括約肌閉合功能。

IGF-1可以通過(guò)優(yōu)化移植微環(huán)境，促進(jìn)移植細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)，并通過(guò)其自分泌或旁分泌的形式釋放VEGF，促進(jìn)局部血液循環(huán)，共同參與尿道括約肌的成肌修復(fù)，進(jìn)而改善尿道括約肌閉合功能，具有潛在治療伴有ISD的SUI作用。

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（收稿日期：2018-03-19）