丹紅合劑保護(hù)腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

鄭君 陳少秀 張曉春

[摘要] 目的 研究丹紅合劑對(duì)腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制。 方法 將48只符合改良局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO）的SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為MCAO組、陽(yáng)性藥組（奈必洛爾）和觀察組（丹紅合劑），每組各16只，干預(yù)1周。分別在干預(yù)前后進(jìn)行Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分，測(cè)量腦梗死體積并檢測(cè)腦梗死組織中NO、一氧化氮合成酶（eNOs）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和Ca2+含量；比較干預(yù)前后大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)皮素-B（ET-B）受體及梗死區(qū)腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）蛋白及其基因表達(dá)。 結(jié)果 與干預(yù)前比較，觀察組干預(yù)后NO、eNOs、SOD、VEGF-mRNA、VEGF蛋白表達(dá)和Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分升高，MDA、ET-B蛋白、ET-B-mRNA表達(dá)、Ca2+量及梗死體積均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。干預(yù)后，觀察組上述指標(biāo)與MCAO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。觀察組VEGF-mRNA、VEGF蛋白表達(dá)、MDA和SOD水平與陽(yáng)性藥組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 丹紅合劑對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 丹紅合劑；腦缺血再灌注損傷；氧化應(yīng)激；神經(jīng)功能

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）06（c）-0016-04

[Abstract] Objective To study the protective mechanism of Danhong Decoction on cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods The 48 SD rats were divided into MCAO group， positive drug group （Nebivolol） and observation group （Danhong Decoction） by random number table， with 16 cases in each group， which were in accordance with the modified focal cerebral ischemia reperfusion model （MCAO）. They were intervened for one week. Before and after intervention， Longa neurological scores were taken to measure cerebral infarct volume and NO， nitric oxide synthase （eNOs）， superoxide dismutase （SOD） and malondialdehyde （MDA） in cerebral infarct tissue and Ca2+ content were detected. The endothelin-B （ET-B） receptors in cerebral cortical microglia and the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） protein and its gene in infarcted brain tissue were compared. Results After intervention， the levels of NO， eNOs， SOD， VEGF-mRNA， VEGF protein and Longa neurological score in the observation group were increased， while the levels of MDA， ET-B protein， ET-B mRNA， Ca2+ and infarct volume were decreased， with statistically significant differences （P < 0.05）. After intervention， the differences of those indices between the observation group and the MCAO group were statistically significant （P < 0.05）. Besides， the differences of VEGF-mRNA， VEGF protein， MDA and SOD levels between the observation group and the positive drug group were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Danhong Decoction has a protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.

[Key words] Danhong Decoction； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Neurological function

急性腦梗死具有起病急驟和致死致殘率高的特點(diǎn)，經(jīng)溶栓干預(yù)后患者神經(jīng)功能多因“腦缺血-再灌注損傷”及“氧化應(yīng)激”而嚴(yán)重受損[1-2]。丹參味辛、性涼，主治心腦腹痛，紅花味辛、性溫，善通利經(jīng)脈，兩者兼用具有“活血化瘀、通經(jīng)祛瘀”之功率[3]。兩者復(fù)方制劑如丹紅注射液在臨床防治心腦血管系統(tǒng)疾病已有應(yīng)用并取得了較好的臨床效果[4]。本研究用太和醫(yī)院自制的“丹紅合劑”對(duì)MCAO模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)腦缺血再灌注后“氧化應(yīng)激”對(duì)血管內(nèi)皮功能及神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性健康SD大鼠70只，8周齡，體質(zhì)量（275±5）g，湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（鄂）2017-0008。動(dòng)物的使用符合3R原則，給予人道關(guān)懷，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。造模后分籠飼養(yǎng)，大鼠自然光照，自由飲水及進(jìn)食（普通飼料），動(dòng)物房濕度（70～80）%，溫度（22～24）℃。

1.2 藥品與試劑

丹紅合劑由太和醫(yī)院中藥房提供（批號(hào)：THYF17 0923）；水合氯醛購(gòu)自揚(yáng)州市奧鑫助劑廠（批號(hào)：302-17-0）；鼠抗人一氧化氮合成酶（eNOs）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）檢測(cè)用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：S01712、S01743）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及NO ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限公司，批號(hào)：H1094、H1103、H1067）；內(nèi)皮素-B（ET-B）多克隆抗體及RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（艾美捷科技有限公司，批號(hào)：01803、018214）。

1.3 MCAO模型制備、分組及干預(yù)

10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥位固定四肢和門齒，消毒后縱行切開(kāi)頸正中皮膚，鈍性分離出頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。結(jié)扎頸外動(dòng)脈，沿頸內(nèi)動(dòng)脈向遠(yuǎn)心端分離出進(jìn)入顱內(nèi)的翼腭動(dòng)脈，然后分別用微動(dòng)脈夾夾閉翼腭動(dòng)脈遠(yuǎn)心端和頸內(nèi)動(dòng)脈近心端，在緊靠頸內(nèi)動(dòng)脈近心端剪一小口，用栓線小心插入，當(dāng)栓線到達(dá)翼腭動(dòng)脈微動(dòng)脈夾夾閉處時(shí)，松開(kāi)微動(dòng)脈夾，緩慢推進(jìn)，當(dāng)手感遇到阻力即可，栓線阻斷供血90 min后抽出以恢復(fù)大腦血流[5]。造模成功標(biāo)準(zhǔn)[6]：術(shù)后12 h以Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分在1～4分的為造模成功。分組：剔除造模后死亡及蛛網(wǎng)膜下腔出血的22只，將48只造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分均為MCAO組、陽(yáng)性藥組和觀察組（n = 16）。干預(yù)：均采用2次/d灌胃方法給藥，共干預(yù)1周。其中MCAO組用90%NaCl灌胃對(duì)照，陽(yáng)性藥組用0.05%奈必洛爾灌胃對(duì)照，觀察組用2%丹紅合劑（1 mL/鼠）灌胃。

1.4 觀察指標(biāo)

采用Griess法檢測(cè)腦組織NO相對(duì)表達(dá)量；采用Western blot法檢測(cè)腦組織eNOs相對(duì)表達(dá)量；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)干預(yù)前后梗死區(qū)腦組織勻漿液SOD及MDA含量；免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測(cè)大腦皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞中內(nèi)皮素-B（ET-B）受體及梗死區(qū)腦組織VEGF的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)定量（RT-PCR）檢測(cè)VEGF和ET-B受體mRNAR表達(dá)，PCR擴(kuò)增引物序列用pfimer5軟件設(shè)計(jì)，檢測(cè)時(shí)先用RNA抽提試劑盒提取梗死區(qū)腦組織中總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；配制PCR的總反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增后RT-PCR分析VEGF和ET-B受體mRNAR表達(dá)水平。其中VEGF基因上游引物：5′-ACAGGCATCGCCTACGCTAC-3′，下游引物：5′-GCATCCTCTAGCTG-ACGCACG-3′。ET-B基因上游引物：5′-CACTCCTGATGATTCCTGTACT-3′，下游引物：5′-ACTCGGTC-ACTGTCCGATC-3′。GAPDH上游引物：5′-ACTACCTGGATACCATCGACTAC-3′，下游引物：5′-CTAACCCTAGCGGATGGTC-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95、52、72℃各30 s，擴(kuò)增47個(gè)循環(huán)。使用curve expert 1.3軟件繪制上述樣本標(biāo)準(zhǔn)曲線（以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)），以目的基因灰度值/GAPDH灰度值表示VEGF mRNAR及ET-B mRNAR的表達(dá)值，讀取上述VEGF mRNAR及ET-B mRNAR濃度。比較腦梗死組織的Ca2+含量和梗死體積，并對(duì)各組干預(yù)前后進(jìn)行Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分以比較干預(yù)對(duì)神經(jīng)功能的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間先采用Levene檢驗(yàn)方差齊性，當(dāng)方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用隨機(jī)設(shè)計(jì)多個(gè)樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹紅合劑對(duì)ET-B、VEGF蛋白及兩者mRNA表達(dá)的影響

MCAO組ET-B蛋白和ET-B mRNA表達(dá)干預(yù)后升高（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA與干預(yù)前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。陽(yáng)性藥組ET-B蛋白和ET-B mRNA干預(yù)后明顯度降低（P < 0.05）；但VEGF蛋白及VEGF mRNA干預(yù)前后無(wú)明顯變化（P > 0.05）。觀察組ET-B蛋白和ET-B mRNA干預(yù)后有一定程度降低，且低于干預(yù)后MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；VEGF蛋白及VEGF mRNA明顯高于干預(yù)前及干預(yù)后MCAO組和陽(yáng)性藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 丹紅合劑對(duì)NO、eNOS、MDA和SOD的影響

與干預(yù)前比較，MCAO組NO、eNOS和SOD干預(yù)后降低，MDA明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與干預(yù)前和干預(yù)后MCAO組比較，陽(yáng)性藥組eNOs及NO顯著升高（P < 0.05），但MDA和SOD無(wú)明顯變化（P > 0.05）。與干預(yù)前比較，觀察組干預(yù)后eNOs、NO和SOD均升高，MDA降低；且eNOs和NO高于干預(yù)后MCAO組，SOD高于干預(yù)后MCAO組和陽(yáng)性藥組，MDA低于MCAO組和陽(yáng)性藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 丹紅合劑對(duì)梗死區(qū)腦組織含Ca2+量、梗死體積和Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分的影響

與干預(yù)前比較，陽(yáng)性藥組和觀察組Ca2+量、梗死體積和Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分均降低，且均低于干預(yù)后MCAO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌血管活性物質(zhì)NO和內(nèi)皮素-1（ET-1）。ET-1屬縮血管因子，而NO屬舒血管因子，NO在eNOs的崔化作用下產(chǎn)生，對(duì)血管具有舒張作用[7-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，NO在腦缺血-再灌注后釋放明顯減少，而ET-1明顯增多，調(diào)節(jié)血管舒縮平衡穩(wěn)態(tài)關(guān)系因此失衡，這會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂而加劇腦缺血-再灌注損傷[10-12]。ET-B受體廣泛存在于血管內(nèi)皮，是ET-1的一種G蛋白偶聯(lián)受體，在缺血缺氧時(shí)可大量誘發(fā)，故ET-B蛋白及ET-B-mRNA高表達(dá)預(yù)示血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重，而兩者表達(dá)降低則預(yù)示腦缺血現(xiàn)象得以改善和糾正[13-14]。除上述血管活性物質(zhì)參與腦損傷外，“氧化應(yīng)激”反應(yīng)也是造成缺血再灌注損傷，如氧自由基、MDA等均是引起的“氧化應(yīng)激”反應(yīng)的重要分子機(jī)制。過(guò)度的“氧化應(yīng)激”反應(yīng)會(huì)增加神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度，減少NO生成而使血管舒張減弱。同時(shí)，Ca2+內(nèi)流會(huì)消耗ATP，后者減少又會(huì)損傷內(nèi)皮細(xì)胞而加重腦損傷[15]。但血管內(nèi)皮損傷具有可逆性，故可應(yīng)用血管和神經(jīng)保護(hù)劑如應(yīng)用鈣離子拮抗劑、自由基清除劑及中醫(yī)藥干預(yù)等防治和修復(fù)損傷內(nèi)皮[16]。增加SOD和促血管新生因子VEGF，清除氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA，抑制“氧化應(yīng)激”反應(yīng)，促進(jìn)缺血區(qū)血管新生以增加腦血流量，這對(duì)促進(jìn)神經(jīng)突觸增生及缺血大腦神經(jīng)重塑具有重要意義[17-18]。

在本實(shí)驗(yàn)中，丹紅合劑在促進(jìn)eNOs活化、刺激內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO、降低ET-B及其-mRNA表達(dá)、拮抗Ca2+內(nèi)流、防止Ca2+超載等方面與β1腎上腺素受體阻滯劑奈必洛爾相似，但弱于奈必洛爾。但丹紅合劑在其他方面具有奈必洛爾所不具備的功能，如降低MDA、提高SOD的合成，這可以抑制和消除氧自由基及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)對(duì)血管內(nèi)皮的傷害性刺激，抑制“氧化應(yīng)激”而發(fā)揮腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。另外，丹紅合劑還具有提高willis動(dòng)脈環(huán)VEGF-mRNA和VEGF蛋白表達(dá)，這有利于缺血區(qū)血管新生、增加腦血流量，促進(jìn)神經(jīng)突觸增生及缺血大腦神經(jīng)重塑，實(shí)驗(yàn)中觀察到觀察組ET-B蛋白及ET-B-mRNA表達(dá)降低就足以證實(shí)腦缺血現(xiàn)象得以改善和糾正。觀察還發(fā)現(xiàn)丹紅合劑可降低梗死區(qū)腦組織含Ca2+量的作用，這一作用與其對(duì)急性心肌梗死的機(jī)制相似，可能是丹紅合劑中的丹參的主要有效成分丹參酮ⅡA發(fā)揮拮抗Ca2+內(nèi)流的作用，因Ca2+內(nèi)流會(huì)消耗ATP，使ATP減少，故丹參拮抗Ca2+內(nèi)流可減少ATP的消耗，這可減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕腦缺血-再灌注損傷造成的腦損傷[19-20]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，丹紅合劑在改善Longa神經(jīng)學(xué)評(píng)分和降低梗死體積方面與奈必洛爾相似，說(shuō)明丹紅合劑具有改善腦損傷神經(jīng)功能的作用。

綜上所述，丹紅合劑除具有與奈必洛爾相似的提高NO、eNOs合成、降低ET-B及其-mRNA表達(dá)、防止Ca2+超載而保護(hù)缺血區(qū)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)腦神經(jīng)功能恢復(fù)外，還可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高VEGF-mRNA和VEGF蛋白表達(dá)而促進(jìn)梗死區(qū)血管新生，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。

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