A組輪狀病毒極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立及臨床評(píng)價(jià)

陳峰 唐曉宇 仇保豐 李林中 嚴(yán)輝

腹瀉病是5歲以下兒童死亡的第二大原因，輪狀病毒（rotavirus，RV）是最常見(jiàn)的引起兒童腹瀉的主要原因。RV感染引起水性腹瀉伴嘔吐和發(fā)燒、嚴(yán)重脫水、電解質(zhì)紊亂，嚴(yán)重者甚至死亡。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）提供的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，中國(guó)在2008年193個(gè)國(guó)家參與的RV引起的死亡統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)中排名第二十三，而在2013年194個(gè)國(guó)家中排名上升到第十五［1］。

RV是一種雙鏈核糖核酸病毒，屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬，病毒基因由11個(gè)雙鏈RNA節(jié)段組成，編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-4，VP6-7）和6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural rotavirus protein 1-6，NSP1-6），根據(jù)VP6抗原性的不同可以分為A-H 8組，其中A組輪狀病毒（rotavirus A，RVA）是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的主要病原體［2-4］。目前，RV的檢測(cè)方法主要有電子顯微鏡（electron microscope，EM）、膠體金法、酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）、核酸雜交法、逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）以及逆轉(zhuǎn)錄定量PCR（reverse real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）。EM購(gòu)買(mǎi)和維護(hù)價(jià)格都比較高，一般的診斷實(shí)驗(yàn)室負(fù)擔(dān)不起；而膠體金法和ELISA直接抗原檢測(cè)靈敏度低。近年來(lái)，RT-PCR、RT-qPCR結(jié)合高效液相色譜法、巢式PCR等核酸檢測(cè)方法都被用于輪狀病毒檢測(cè)，并被認(rèn)為具有比直接抗原檢測(cè)更高的靈敏度，但存在耗時(shí)較長(zhǎng)的缺點(diǎn)［5-9］，不能滿(mǎn)足RVA發(fā)病急、需要隨到隨檢的快速檢測(cè)要求。有文獻(xiàn)報(bào)道新的商品化分子診斷方法FilmArra和Luminex xTAG實(shí)現(xiàn)了RVA核酸快速檢測(cè)［10-12］，但其高昂的價(jià)格限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此建立一種快速、準(zhǔn)確、低成本的RVA檢測(cè)方法能夠?yàn)榕R床上實(shí)現(xiàn)輪狀病毒的快速診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)提供有力的技術(shù)支撐，對(duì)該病防控具有重要意義。

本研究旨在建立一種快速檢測(cè)RVA的方法，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的性能分析和臨床性能評(píng)價(jià)，以明確該方法在臨床應(yīng)用上的可行性。

1 材料和方法

1.1 病毒株和臨床樣本

1.1.1 病毒株

RVA毒株購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），編號(hào)VR-2104和VR-2018；特異性病原體包括F組腸道腺病毒40型、F組腸道腺病毒41型、腸道病毒71型、空腸彎曲桿菌、艱難梭菌，購(gòu)自ATCC，編號(hào)分別為VR-931、VR-930、VR-1775、VR-37、33560、9689，腸炎沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（National Center for Medical Culture Collection，CMCC），編號(hào)50041和51571，諾如病毒為臨床樣本，來(lái)源于南通出入境檢驗(yàn)檢疫局。

1.1.2 臨床樣本

收集南通市出入境檢驗(yàn)檢疫局、南通市婦幼保健院中臨床癥狀符合《兒童腹瀉病診斷治療原則的專(zhuān)家共識(shí)（2009年版）》［13］描述的嬰幼兒腹瀉的臨床樣本共200例，其中男性病例119例，女性病例81例，年齡32天～6.1歲，平均年齡6.02歲。為考查臨床特異性，還收集其它消化道細(xì)菌或病毒感染引起的嬰幼兒腹瀉、非感染性嬰幼兒腹瀉及健康嬰幼兒。標(biāo)本類(lèi)型為糞便。

1.2 主要試劑和儀器

一步RT-PCR Master Mix（極速）（貨號(hào)：G0105）、極速熒光定量PCR儀V280均購(gòu)自南京美寧康誠(chéng)生物科技有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（離心柱法）（貨號(hào)：DP315）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)

從Genbank中查找并選擇RVA基因組中NSP3基因的序列，利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)一對(duì)引物和一條熒光探針，序列分別為上游引物RVAF：5′-GTTGATGCTCAAGATGGAGT-3′，下游引物RVA-R：5′-ACTTCATTGTAATCATATTGAATA CC-3′，熒光探針RVA-P：5′-（FAM）-CAGCAACAACTGCAGCTTCAAAAGAAGTGT-（BHQ1）-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度129 bp，經(jīng)BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)僅與RVA株的基因組序列完全匹配，而和其它物種的核酸序列均不匹配。引物和熒光探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 質(zhì)控品的建立

利用空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行RVA培養(yǎng)上清標(biāo)定，將標(biāo)定后病毒培養(yǎng)上清稀釋到1.0×106PFU/mL，存活后作為陽(yáng)性質(zhì)控品。滅菌的生理鹽水作為陰性質(zhì)控品。每次實(shí)驗(yàn)待檢樣本需與陰陽(yáng)質(zhì)控品同時(shí)檢測(cè)，用于實(shí)驗(yàn)質(zhì)控。其中陰性質(zhì)控品要求無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線或無(wú)循環(huán)閾值（cycle threshold value，Ct值）顯示；陽(yáng)性質(zhì)控品要求呈典型S型擴(kuò)增曲線且Ct值≤30。

1.5 核酸提取

用糞便采集拭子，取糞便或腹瀉物5～8 g，置入無(wú)菌糞便收集管（含1 mL生理鹽水），糞便懸液靜置2 min，或6 000 r/min離心30 s，取200 μL上清進(jìn)行核酸提取。陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品200 μL與待檢樣本同步進(jìn)行處理。具體提取步驟請(qǐng)參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（離心柱法）說(shuō)明書(shū)。提取的核酸可直接用于檢測(cè)，也可保存于-70℃待用。

1.6 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)

將提取后的核酸樣本3 μL加入到7 μL RVA RT-PCR反應(yīng)液中（含上下游引物RVA-F、RVA-R各10 pmol，熒光探針RVA-P 5 pmol，一步RTPCR Master Mix 5 μL），取8 μL移至PCR擴(kuò)增芯片中，蓋上芯片蓋，使用極速熒光定量PCR儀V280進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄5 min；95℃預(yù)變性8 s；93℃7 s、60℃14 s，共40個(gè)循環(huán)。由于利用ROC曲線確定了本檢測(cè)方法的Cutoff值為38，因此V280 RT-PCR實(shí)時(shí)分析軟件計(jì)算每個(gè)樣本的Ct值，結(jié)合擴(kuò)增曲線的形狀即可判斷樣本的陰陽(yáng)性，如果樣本呈典型S型擴(kuò)增曲線，且Ct值≤38，則判定為陽(yáng)性，樣本無(wú)典型S型擴(kuò)增曲線或者呈典型S型擴(kuò)增曲線，但Ct值＞38，則判定為陰性。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用EXCEL軟件進(jìn)行精密度分析，SPSS 18.0軟件進(jìn)行Kappa一致性分析，Origin8軟件進(jìn)行靈敏度分析。

2 結(jié)果

2.1 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

將不同來(lái)源的RVA陰、陽(yáng)性樣本各8份進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，圖1A中8份陽(yáng)性樣本均呈現(xiàn)出典型的S型曲線，且Ct值均小于38；圖1B中8份陰性樣本均無(wú)典型S型曲線，見(jiàn)圖1。

RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，8份陽(yáng)性樣本全部可見(jiàn)129 bp的RVA特征條帶（見(jiàn)圖2），8份陰性樣本全部未見(jiàn)129 bp的RVA特征條帶，見(jiàn)圖3。

RAV陽(yáng)性標(biāo)本的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示均為RVA基因組編碼非結(jié)構(gòu)蛋白3（NSP3）基因的序列。

2.2 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法靈敏度分析

將經(jīng)過(guò)空斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)標(biāo)定濃度為5.32×108PFU/mL的RVA病毒上清分別稀釋至1.0×105PFU/mL、1.0×104PFU/mL、1.0×103PFU/mL、5.0×102PFU/mL、1.0×102PFU/mL、50 PFU/mL、10 PFU/mL、5 PFU/mL，使用極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行24次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。

圖1 陰、陽(yáng)性樣本的極速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 1 The results of ultrafast real-time RT-PCR，including positive and negative samples

圖2 8份陽(yáng)性標(biāo)本PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Figure 2 The electrophoresis results of RT-PCR amplified products

圖3 8份陰性標(biāo)本PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Figure 3 The electrophoresis results of RT-PCR amplified products

按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）EP17-A文件的要求，以樣本濃度值的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，檢出率為縱坐標(biāo)進(jìn)行描點(diǎn)，用Origin軟件的Sigmoidal Fit方法擬合曲線，根據(jù)軟件給出的曲線公式y(tǒng)=1-0.833 3/（1+exp（（x-1.699 02）/0.215 05）），計(jì)算出當(dāng)檢出率為95%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為2.00×102PFU/mL，此濃度即為本方法的靈敏度，見(jiàn)圖5。

圖4 RVA陽(yáng)性標(biāo)本的RT-PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序圖Figure 4 The RVA positive sample sequencing result of RT-PCR amplified products

表1 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Sensitivity test result of ultrafast real-time RT-PCR

圖5 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法靈敏度的Sigmoidal擬合曲線Figure 5 Sigmoidal fitting curve of the detection sensitivity of real-time RT-PCR

上述樣本同時(shí)采用RT-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示1.0×105PFU/mL和1.0×104PFU/mL的樣本可見(jiàn)129 bp的目的條帶，而其余濃度樣本均無(wú)目的條帶（圖6），因此RT-PCR方法能夠檢出的最低樣本濃度為1.0×104PFU/mL。

圖6 不同濃度樣本PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Figure 6 The electrophoresis results of RT-PCR amplified products for different concentration samples

2.3 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法特異性分析

為了驗(yàn)證極速熒光RT-PCR方法的特異性，分別使用種屬相近的、感染部位相同及引起癥狀相似的其他病原，包括F組腸道腺病毒40型、F組腸道腺病毒41型、腸道病毒71型、空腸彎曲桿菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、諾如病毒作為待檢樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，見(jiàn)圖7所示。

圖7 特異性病原體極速實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 7 The results of ultrafast real-time RT-PCR for Specific pathogens

同時(shí)使用RT-PCR方法對(duì)上述病原體樣本進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果均無(wú)目的條帶。因此其他病原體對(duì)極速熒光RT-PCR方法和RT-PCR方法的檢測(cè)均無(wú)干擾，不存在交叉反應(yīng)。

2.4 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法精密度分析

以1.0×107PFU/mL、1.0×106PFU/mL、1.0×105PFU/mL、1.0×104PFU/mL、1.0×103PFU/mL 5個(gè)不同濃度的RVA病毒上清作為待檢樣本，使用極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法進(jìn)行30次重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果如表2，Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差在0.19～0.43之間，變異系數(shù)（CV）在0.82%～2.28%之間，證實(shí)本方法可以滿(mǎn)足檢測(cè)的精密度要求。

圖8 特異性病原體PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Figure 8 The electrophoresis results of RT-PCR amplified products for Specific pathogens

2.5 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法與測(cè)序方法臨床樣本檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

對(duì)南通市出入境檢驗(yàn)檢疫局、南通市婦幼保健院共200例臨床樣本同時(shí)采用本研究建立的極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法和測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表3所示。其中陽(yáng)性符合率達(dá)100%，陰性符合率達(dá)97.4%，總符合率達(dá)到98.5%。

表2 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法精密度檢測(cè)結(jié)果Table 2 Precision test results of ultrafast real-time RT-PCR

表3 極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法與測(cè)序方法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Table 3 The results compared between ultrafast real-time RT-PCR and nucleotide sequencing

3 討論

RVA是導(dǎo)致嬰幼兒腹瀉的最重要的病原體，是導(dǎo)致5歲以下嬰幼兒腹瀉的主要原因［14］。在我國(guó)，RV感染的發(fā)病率高達(dá)30%～40%，這種現(xiàn)狀不僅對(duì)我國(guó)嬰幼兒的生活質(zhì)量構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅，而且也對(duì)我們國(guó)家的醫(yī)療資源造成了巨大的損失，給兒童健康帶來(lái)嚴(yán)重危害，大大增加了防控任務(wù)難度［15-17］。

RVA經(jīng)糞-口途徑傳播，檢測(cè)方法目前在臨床上積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，其技術(shù)的主要開(kāi)發(fā)方向是開(kāi)發(fā)實(shí)用、經(jīng)濟(jì)，且適用基層實(shí)驗(yàn)室的快速檢測(cè)方法［18］。本研究開(kāi)發(fā)了一種極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)RVA的方法，該方法最低檢測(cè)限達(dá)到2.00×102PFU/ml，Ct值的變異系數(shù)小于2.5%，200例腹瀉樣本的研究發(fā)現(xiàn)，本方法與金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比，陽(yáng)性符合率達(dá)100%，陰性符合率達(dá)97.4%，總符合率達(dá)到98.5%，能夠?qū)Ω篂a樣本中病原體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，對(duì)疫情控制具有重要作用。

目前，基于各種檢測(cè)原理的RVA的檢測(cè)方法逐漸被應(yīng)用于臨床。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如ELISA，雖然是WHO推薦的檢測(cè)方法，但該方法要求被測(cè)樣本病毒含量足夠高才能達(dá)到其檢出限，相較于RT-PCR檢測(cè)方法其漏診率高［19-21］。本研究建立的極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法最低檢測(cè)限達(dá)到2.00×102PFU/mL，靈敏度比普通RT-PCR方法高10倍［22］，極大地降低了臨床漏診率。此外，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)基于方法學(xué)局限性容易出現(xiàn)輪狀病毒組間交叉反應(yīng)［23］，造成特異性偏低。本研究中對(duì)F組腸道腺病毒40型、F組腸道腺病毒41型、腸道病毒71型、空腸彎曲桿菌、艱難梭菌、腸炎沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、諾如病毒等樣本均進(jìn)行了極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明該方法對(duì)種屬相近或引起相似癥狀的其他種屬病毒無(wú)交叉反應(yīng)，結(jié)果與其他基于RT-PCR原理的檢測(cè)方法一致［24］。RT-PCR過(guò)程中還存在一個(gè)重要參數(shù)即Ct值，Ct值可以幫助臨床醫(yī)生確定疾病病因，病毒載量的高低可以為臨床醫(yī)生評(píng)判疾病過(guò)程提供更有力的證據(jù)［19，25］。本研究建立的RVA檢測(cè)方法不同濃度的樣本Ct值范圍在（17.28±0.39）～（29.69±0.43）之間，相較于文獻(xiàn)中報(bào)道的基于RT-PCR原理的RVA檢測(cè)方法Ct值范圍26.18～36.01更低，表明本方法的檢測(cè)靈敏度更高［26］。不同濃度樣本的Ct值的變異系數(shù)在0.82%～2.28%之間小于2.5%，也表明本研究所建立的RVA檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性，適用于臨床檢測(cè)。此外，200例臨床腹瀉樣本的研究結(jié)果顯示，本研究新建立的極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法與一代測(cè)序檢測(cè)方法有著良好的等效性，陽(yáng)性符合率達(dá)100%，陰性符合率達(dá)97.4%，總符合率達(dá)到98.5%，Kappa值為0.969，表明本研究的檢測(cè)方法與現(xiàn)有的金標(biāo)準(zhǔn)測(cè)序方法檢測(cè)性能一致性良好，說(shuō)明本研究所建立的極速實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法具有臨床可應(yīng)用性。

鑒于RVA對(duì)嬰幼兒的危害嚴(yán)重，且其流行病學(xué)研究顯示RV在人群中流行的基因型會(huì)隨時(shí)間、地區(qū)的不同而產(chǎn)生變化［27-28］，因此及時(shí)明確嬰幼兒腹瀉的根本原因有助于臨床醫(yī)師及時(shí)診斷和正確治療輪狀病毒性腸炎，并能動(dòng)態(tài)了解該病的流行情況，對(duì)指導(dǎo)和預(yù)防該病具有重要意義［29-30］。本研究中僅對(duì)200例臨床樣本進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)分析，尚需更大的臨床樣本數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行性能優(yōu)化，研究結(jié)果顯示本研究建立的方法較目前臨床上使用的其他檢測(cè)方法成本低，且具有不易污染、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短的特點(diǎn)，更適合我國(guó)國(guó)情，有利于在我國(guó)推廣。