2017年度人EGFR基因突變檢測試劑盒抽驗(yàn)質(zhì)量分析

孫楠 于婷 黃杰 曲守方

人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)組成。其中胞內(nèi)區(qū)為酪氨酸激酶功能區(qū)，由EGFR的18～24號(hào)外顯子編碼。EGFR突變主要發(fā)生在胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域的前4個(gè)外顯子上（18～21），其中外顯子19和外顯子21突變最為常見，是EGFR酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）的敏感性突變［1-3］。而發(fā)生在外顯子20上的T790M突變?yōu)镋GFR-TKI耐藥突變［4］。目前，EGFR-TKI是非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）治療中研究最多、證據(jù)最充分、應(yīng)用最廣泛的分子靶向治療藥物。因此，了解EGFR基因突變狀態(tài)是臨床衡量腫瘤患者對(duì)EGFR-TKI療效的最重要手段。

針對(duì)EGFR基因突變檢測方法有直接測序法（sanger sequencing）、探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法（amplification refractory mutation system，ARMS）、熒光原位雜交法（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）［5］、高分辨熔點(diǎn)曲線分析法（high resolution metling，HRM）［6］、變性高效液相色譜技術(shù)（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）［7］、數(shù)字PCR（digital PCR）［8］以及二代測序（next-generation sequencing，NGS）等［9］。 其中，直接測序由于技術(shù)的可靠性以及相對(duì)簡單的操作使其成為基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［10］。ARMS熒光定量PCR法是檢測EGFR基因突變最常用的方法［11］。目前我國有很多企業(yè)研制針對(duì)EGFR基因突變檢測的診斷試劑盒，主要用于檢測人EGFR基因中的18-21外顯子上的常見突變。然而，各廠家試劑盒質(zhì)量參差不齊，不能完全滿足臨床診斷需求。因此，本文對(duì)抽樣的8家企業(yè)9批次EGFR基因突變檢測試劑盒進(jìn)行檢測，分別采用各企業(yè)參考品以及國家參考品對(duì)抽檢試劑盒進(jìn)行性能評(píng)估，以期了解各廠家研制的EGFR基因突變檢測試劑盒質(zhì)量情況。

1 材料與方法

1.1 材料

從8家使用單位和生產(chǎn)企業(yè)（武漢海吉力生物科技有限公司；廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司；益善生物技術(shù)股份有限公司；北京雅康博生物科技有限公司；無錫市銳奇基因生物科技有限公司；上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司；武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司；江蘇為真生物醫(yī)藥技術(shù)股份有限公司）共抽檢到9批次的“人EGFR基因突變檢測試劑盒”，用于本研究抽驗(yàn)對(duì)象。其中熒光PCR法8批次，流式熒光雜交法1批次。同時(shí)由各單位提供企業(yè)參考品用于評(píng)價(jià)抽檢試劑盒是否符合該生產(chǎn)廠家的注冊標(biāo)準(zhǔn)。

使用臨床樣本來源的人類EGFR基因突變檢測統(tǒng)一參考品，用于探索性研究測試本次抽檢的5個(gè)批次試劑盒。該參考品濃度為2 ng/μL，通過已獲注冊證的EGFR試劑盒（廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司）對(duì)臨床樣本進(jìn)行初篩，再用Sanger測序法進(jìn)行確認(rèn)突變位點(diǎn)信息。該參考品包括：①陽性參考品P1-P7，來源于7例非小細(xì)胞肺癌患者的FFPE樣本，經(jīng)Sanger測序驗(yàn)證具有相對(duì)應(yīng)的EGFR基因突變位點(diǎn)，突變類型包括19-Del、L858R、T790M、20-ins、G719X、S768I、L861Q。②陰性參考品N1-N3，來源于3例臨床上經(jīng)過Sanger測序法檢測EGFR基因突變均為陰性的非小細(xì)胞肺癌患者的FFPE樣本。③檢測限參考品L1-L21，經(jīng)數(shù)字PCR定量確定突變比率為1%的樣本。④重復(fù)性參考品P1-P3，P1為野生型樣本、P2和P3分別具有EGFR19-Del突變以及S768I突變的樣本。

1.2 方法

1.2.1 以企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品技術(shù)要求檢驗(yàn)

采用各企業(yè)提供參考品，分別檢測對(duì)應(yīng)抽檢的檢測試劑盒。所有檢驗(yàn)均按照企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品技術(shù)要求進(jìn)行，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括準(zhǔn)確性（陽性參考品符合率）、特異性（陰性參考品符合率）、檢測限和重復(fù)性。操作步驟嚴(yán)格按照各企業(yè)檢測試劑盒說明書的要求進(jìn)行，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

為了驗(yàn)證抽驗(yàn)試劑盒的有效性，選取一家生產(chǎn)廠家的抽檢試劑盒（熒光PCR法），分別從不同抽樣環(huán)節(jié)、不同適用機(jī)型以及不同樣本類型進(jìn)行檢測，對(duì)比分析不同條件下試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、檢測限以及精密度。①從生產(chǎn)環(huán)節(jié)和使用環(huán)節(jié)抽取相同批號(hào)的試劑進(jìn)行測定；②根據(jù)其說明書中適用機(jī)型，分別選取PCR測定儀Stratagene Mx3000P（Agilent，美國）和PCR測定儀ABI-7500（Life Tech，美國）進(jìn)行測定；③針對(duì)檢測樣本適用于組織樣本和外周血樣本，分別設(shè)置最低檢出限要求進(jìn)行測定（病理組織樣本在10 ng/μL野生型基因組DNA背景下，對(duì)突變DNA含量為5%的檢測限參考品能夠準(zhǔn)確檢出；外周血樣本在突變DNA含量為10%背景下，對(duì)DNA濃度為1 ng/μL的檢測限參考品能夠準(zhǔn)確檢出。）

1.2.2 探索性研究

采用人類EGFR基因突變檢測統(tǒng)一參考品對(duì)本次抽驗(yàn)的5個(gè)EGFR檢測試劑盒進(jìn)行探索性研究。參照產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《人類EGFR基因突變檢測試劑盒》［12］報(bào)批稿的要求，同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、重復(fù)性和檢測限項(xiàng)目的檢驗(yàn)。操作步驟嚴(yán)格按照各企業(yè)檢測試劑盒說明書的要求進(jìn)行，最后對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別統(tǒng)計(jì)樣本Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。采用Ct值的CV用于考察試劑盒的精密度。

2 結(jié)果

2.1 以企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品技術(shù)要求檢驗(yàn)

9批次EGFR基因突變檢測劑盒準(zhǔn)確性、特異性和檢測限分別符合各企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品技術(shù)要求，重復(fù)性檢測中，1批次由于抽樣量不足，未進(jìn)行檢測，其他8批次均符合規(guī)定。

本次監(jiān)督抽驗(yàn)對(duì)同一生產(chǎn)廠家，分別從不同抽樣環(huán)節(jié)、不同適用機(jī)型以及不同樣本類型進(jìn)行檢測，對(duì)比分析不同條件下試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、檢測限以及精密度。根據(jù)表1結(jié)果表明不同抽樣環(huán)節(jié)的試劑盒以及不同適用機(jī)型條件下的檢測結(jié)果均符合該生產(chǎn)廠家的注冊標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)圖1中病理組織樣本和外周血樣本檢測擴(kuò)增曲線和熔解曲線結(jié)果可知，病理組織樣本在10 ng/μL野生型基因組DNA背景下，對(duì)突變DNA含量為5%的檢測限參考品能夠準(zhǔn)確檢出；外周血樣本在突變DNA含量為10%背景下，對(duì)DNA濃度為1 ng/μL的檢測限參考品能夠準(zhǔn)確檢出。在針對(duì)組織樣本和外周血漿樣本的檢測中，試劑盒均符合該生產(chǎn)廠家的注冊標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 探索性研究

在本次抽驗(yàn)的探索性研究中，參照產(chǎn)品行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《人類EGFR基因突變檢測試劑盒》報(bào)批稿的要求，同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確性（陽性符合率）、特異性（陰性符合率）、重復(fù)性和檢測限項(xiàng)目的檢驗(yàn)。對(duì)5個(gè)EGFR檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果表明準(zhǔn)確性和檢測限均有1批次的1個(gè)突變位點(diǎn)未檢出（表2）。

表1 不同抽樣環(huán)節(jié)獲取同一試劑以及不同適用機(jī)型同一試劑檢測結(jié)果比對(duì)Table 1 Comparison of the results obtained by different reagents in different sampling procedures and detected from various applicable instruments

在特異性指標(biāo)中，有5家產(chǎn)品僅對(duì)不同濃度的野生型DNA樣本進(jìn)行了規(guī)定，要求不得檢出，而對(duì)于EGFR基因不同序列之間以及HER家族之間是否存在交叉反應(yīng)并未進(jìn)行要求，其企業(yè)參考品也沒有做相應(yīng)的設(shè)置，無法充分檢測試劑盒的交叉反應(yīng)。在探索性研究中，我們對(duì)試劑盒檢測范圍外的人類EGFR不同突變類型參考品進(jìn)行了檢測，包括21個(gè)突變位點(diǎn)，要求結(jié)果應(yīng)為突變陰性。檢測結(jié)果顯示5批試劑盒均符合要求，未發(fā)現(xiàn)交叉現(xiàn)象。

對(duì)于精密度指標(biāo)，抽檢的有部分產(chǎn)品僅要求結(jié)果均為陽性，并未對(duì)Ct值的變異系數(shù)做出要求。僅有2家產(chǎn)品在驗(yàn)證精密度時(shí)包括弱陽性、中或強(qiáng)陽性參考品和陰性參考品。其他6家均只對(duì)中/強(qiáng)陽性精密度參考品進(jìn)行檢測，且以常見突變類型為主，并未包括理論上較難測得的突變序列。在探索性研究中，我們分別對(duì)弱陽性、中或強(qiáng)陽性參考品和陰性參考品進(jìn)行檢測，并選取了較為常見的19-del缺失突變以及較為少見的S768I突變位點(diǎn)。檢測結(jié)果顯示，抽檢的5批試劑盒中4個(gè)PCR方法的試劑其變異系數(shù)均小于5%，另外1個(gè)流式熒光雜交法試劑也能結(jié)果一致均為陽性，符合規(guī)定。

3 討論

在中國，EGFR基因突變檢測試劑盒屬于三類體外診斷試劑，須由國家食品藥品監(jiān)督管理總局審查批準(zhǔn)后才能頒發(fā)醫(yī)療器械注冊證。因此，在臨床應(yīng)用中，試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、檢測限、重復(fù)性都是質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)，能夠反映試劑的基本特性。因此，本研究選取這幾項(xiàng)指標(biāo)來進(jìn)行試劑盒性能評(píng)價(jià)。對(duì)于無行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家參考品的產(chǎn)品，企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)品注冊檢驗(yàn)時(shí)通常會(huì)采用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和參考品進(jìn)行檢驗(yàn)；對(duì)于有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家參考品的情況下，檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)會(huì)采用行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和國家參考品來進(jìn)行注冊檢驗(yàn)［13］。然而，針對(duì)EGFR基因突變檢測的相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)遲于大部分企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，企業(yè)在研制過程主要依靠企業(yè)的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)/技術(shù)要求進(jìn)行。

圖1 G719A基因檢測限結(jié)果Figure 1 Detection limit results of G719A gene

表2 EGFR基因突變檢測試劑盒結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of the detection results of EGFR mutation detection kits

本文采用企業(yè)參考品對(duì)各自抽檢試劑盒（分型或不分型）所能覆蓋的所有突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，相應(yīng)基因型別均能檢測出。各企業(yè)生產(chǎn)的EGFR基因突變檢測試劑盒也都能符合企業(yè)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)/技術(shù)要求。但是企業(yè)參考品均來源于質(zhì)粒構(gòu)建，并未采用臨床樣本提取的DNA儲(chǔ)備液或細(xì)胞系作為原料，所以不能很好的模擬樣本真實(shí)情況。因此企業(yè)參考品無法正確評(píng)估檢測試劑盒的臨床使用情況。鑒于此，本文采用前期制備的臨床樣本來源人類EGFR基因突變檢測統(tǒng)一參考品分別驗(yàn)證抽樣試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性、檢測限和重復(fù)性。

EGFR是表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor HER）家族成員之一。該家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4 4個(gè)分子構(gòu)成，在細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，EGFR突變主要發(fā)生在外顯子18～21號(hào)外顯子上。其中外顯子19的缺失突變delE746-A750等約占EGFR突變的45%，外顯子21上的L858R替代突變約占EGFR突變的40%～45%［14］。另外10%的EGFR突變發(fā)生在外顯子18（G719A、G719C和G719S）和外顯子20上［14-15］。其中外顯子20上的S768I突變約占非小細(xì)胞肺癌患者EGFR突變的1.5%～3%左右［16］。本次抽驗(yàn)的EGFR試劑盒所檢測的突變位點(diǎn)和數(shù)量存在一定的差異，有的僅僅檢測2個(gè)基因型的10個(gè)突變位點(diǎn)，有的基本覆蓋常見的30多種突變位點(diǎn)。在探索性研究中，我們采用的統(tǒng)一參考品以臨床樣本作為原料，覆蓋18～21號(hào)外顯子共4個(gè)基因型別的突變類型，可以滿足不同試劑盒質(zhì)控檢測的需要。

在探索性研究中，抽檢的5批試劑盒在準(zhǔn)確性項(xiàng)目中有1個(gè)廠家的試劑盒1個(gè)位點(diǎn)未檢出。準(zhǔn)確性檢測不符合規(guī)定則說明產(chǎn)品出現(xiàn)漏檢及假陰性的現(xiàn)象。分析主要原因可能是產(chǎn)品設(shè)定的閾值較高，將弱陽性樣本檢測為陰性。通常在檢測限設(shè)置時(shí)，應(yīng)分別對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和反應(yīng)體系中總核酸濃度2個(gè)因素做出規(guī)定，在本次抽驗(yàn)的EGFR試劑盒產(chǎn)品中企業(yè)注冊標(biāo)準(zhǔn)/產(chǎn)品注冊要求僅對(duì)突變比率進(jìn)行了要求。另外，檢測限的檢測應(yīng)覆蓋所有突變位點(diǎn)，而有的EGFR試劑盒產(chǎn)品僅對(duì)部分突變位點(diǎn)的檢測限進(jìn)行了檢測。在探索性研究中，我們要求試劑盒在10 ng基因組背景下能夠檢出突變比例（拷貝數(shù)）不高于5.0%的混合樣本且型別準(zhǔn)確。在統(tǒng)一參考品的檢出下，有1個(gè)產(chǎn)品檢測限不符合要求。檢測限不符合規(guī)定則說明產(chǎn)品的靈敏度不夠，對(duì)于突變頻率較低的樣本無法檢出。由此可見，企業(yè)提供的參考品和統(tǒng)一參考品對(duì)試劑盒的測試存在差異。注冊檢驗(yàn)時(shí)采用企業(yè)參考品不能完全滿足臨床對(duì)診斷試劑盒的質(zhì)量要求。因此，針對(duì)EGFR基因突變檢測試劑盒的國家參考品以及相應(yīng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于產(chǎn)品質(zhì)量把控具有十分重要的作用。

臨床常用的檢測樣本類型有腫瘤組織基因組DNA和外周血中的游離DNA。其中，組織樣本是基因突變檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”［17］。血液樣本可作為組織樣本不易獲取時(shí)的補(bǔ)充樣本［18］。本文抽驗(yàn)的試劑盒中，有部分廠家產(chǎn)品說明書的預(yù)期用途中表明該產(chǎn)品用于體外定性檢測腸癌、肺癌患者石蠟包埋病理標(biāo)本和外周血分離的血漿樣本的DNA中人類EGFR基因突變。由于EGFR病理組織學(xué)樣本和外周血樣本檢測中存在較大差異性，在參考品及質(zhì)控品設(shè)置、分析性能評(píng)估、臨床評(píng)價(jià)要求、產(chǎn)品技術(shù)要求、產(chǎn)品說明書等多個(gè)方面均存在不同要求。本文對(duì)同一廠家試劑盒分別采用病理組織樣本和外周血樣本檢測，檢測結(jié)果符合該生產(chǎn)廠家的注冊標(biāo)準(zhǔn)。

總之，各企業(yè)產(chǎn)品技術(shù)要求存在差異，企業(yè)參考品及產(chǎn)品技術(shù)要求并不能完全反應(yīng)試劑盒的質(zhì)量，結(jié)果與即將正式實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)有一定差距。張欣濤等［19］在2013-2016年的監(jiān)督抽驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)存在企業(yè)產(chǎn)品技術(shù)要求低于國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的情況。因此，針對(duì)我國人EGFR基因突變檢測試劑盒的發(fā)展現(xiàn)狀，建議企業(yè)及時(shí)根據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)更新企業(yè)技術(shù)要求，并統(tǒng)一使用國家參考品進(jìn)行檢測。