靜脈注射移植ADSCs對兔早期激素性股骨頭壞死的干預作用及其機制

譚偉源，安榮澤，齊新文，楊顯紅，胡金金

(遵義醫(yī)學院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海519100)

激素性股骨頭壞死(SANFH)是由于長期大劑量使用激素引起的股骨頭供血障礙，最終導致股骨頭塌陷的一種疾病，股骨頭置換為其主要治療方法[1,2]。目前針對SANFH的保髖治療方法主要有髓芯減壓、帶血管蒂骨瓣移植等，均具有一定療效，但遠期治療效果欠佳[3]。近年來，干細胞工程的迅速發(fā)展有可能為SANFH的保髖治療帶來新的希望。脂肪源性干細胞(以下稱脂肪干細胞)具有強大的體外擴增及分化能力,與其他類型干細胞相比，具有取材容易、來源廣泛等優(yōu)點，是目前組織工程研究中較理想的種子細胞[4]。目前脂肪干細胞經(jīng)關節(jié)局部注射移植的方法已廣泛應用于股骨頭壞死的動物實驗，該方法移植效果較好，但具有一定的創(chuàng)傷性[5]。2017年6月～2018年1月，本研究觀察了靜脈注射移植脂肪干細胞對兔早期SANFH的干預效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：8月齡新西蘭大白兔45只，雌雄不限，體質量2.5～3 kg，購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)20140035。實驗動物分籠飼養(yǎng)，自由進食、飲水。主要試劑：Hyclone馬血清、DMEM高糖液體培養(yǎng)基(華聯(lián)科生物技術有限公司)，甲基強的松龍注射液(5 mL:125 mg，武漢新星生物藥業(yè)有限公司)，免疫組化EliVision plus試劑盒(福州邁新科技有限公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)。主要儀器：DR影像X射線機、磁共振儀(德國西門子中國有限公司)，Hema9600基因擴增儀(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)，多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)。

1.2 兔脂肪干細胞分離培養(yǎng) 于45只新西蘭大白兔中隨機選取3只，稱質量后予10%水合氯醛麻醉，取俯臥位，剪除頸背部兔毛，消毒鋪巾。切取頸背部脂肪組織共3 g，剔除淺筋膜及血管組織，PBS反復沖冼后，用剪刀剪至糊狀。加入0.1%Ⅰ型膠原酶消化，離心后棄上清，予完全培養(yǎng)基重懸，接種于T25培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，2天后進行換液，此后約每3天換液。當細胞融合度達80%時，加入0.25% Trypsin-0.04% EDTA 1 mL進行消化，按1∶4進行傳代。取第3代脂肪干細胞備用，消化后加入單純DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細胞，制成密度為1×106個/mL的細胞懸液。

1.3 SANFH模型建立及脂肪干細胞移植 取剩余42只新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈一次性注射馬血清10 mL/kg，注射3周時再次注射馬血清5 mL/kg；2周后經(jīng)腹腔注射甲基強的松龍5 mL/kg，1次/d，連續(xù)3天；每次注射馬血清及第一次注射甲基強的松龍后當日起，每日一次肌注青霉素10萬U預防感染，連續(xù)肌注7天。最后一次腹腔注射甲基強的松龍后4周，予10%水合氯醛麻醉，取俯臥位、后足伸位，并予膠布固定。采用DR影像X射線機、磁共振儀行髖部X線攝片及磁共振成像檢查。造模成功標準：X線片見股骨頭密度欠均勻及囊性透亮區(qū)，骨小梁模糊不清；髖關節(jié)磁共振T1W1像見股骨頭軟骨下帶狀低信號，關節(jié)積液增多。本組共37只兔X線片及磁共振檢查符合早期股骨頭壞死的影像學表現(xiàn)，證實造模成功。從造模成功的SANFH兔中隨機選取36只，隨機分為模型組、局部注射組、靜脈注射組，每組12只。局部注射組10%水合氯醛麻醉，左髖部備皮、消毒、鋪無菌巾，予5 mL注射器行左髖關節(jié)穿刺，DR影像X射線機定位下見注射器尖端達股骨頭后，注射脂肪干細胞 5 mL。靜脈注射組兔左耳緣局部備皮消毒后，從耳緣靜脈注射脂肪干細胞 5 mL。局部注射組、靜脈注射組于注射當日起每日一次肌注青霉素10萬U預防感染，連續(xù)肌注7天。模型組不作任何處理。

1.4 相關指標觀察

1.4.1 局部感染情況 每日觀察局部注射組及靜脈注射組注射部位，出現(xiàn)紅腫及潰爛判為局部感染，記錄兩組感染情況。

1.4.2 股骨頭外形、骨密度及骨小梁變化 各組干預后第4、8周隨機選取6只SANFH兔，10%水合氯醛麻醉，取俯臥位、后足伸位，并予膠布固定。DR影像X射線機行髖關節(jié)X線正位攝片，觀察股骨頭外形、骨密度及骨小梁變化。

1.4.3 股骨頭組織病理學表現(xiàn) 各組干預第4、8周X線檢查結束后分別采用水合氯醛過量麻醉的方法處死動物，取各組左側股骨頭，部分股骨頭組織液氮保存；部分股骨頭組織采用4%多聚甲醛室溫固定24 h，經(jīng)脫鈣、脫水、透蠟、包埋切片、切片脫蠟至水，進行HE染色。顯微鏡下觀察骨細胞、骨小梁、空骨陷窩情況。

1.4.4 股骨頭組織骨形態(tài)蛋白2(BMP-2)mRNA表達 采用實時熒光定量PCR法。取各組干預后第4、8周液氮保存的股骨頭組織150 mg，充分研磨成粉末狀，將粉末轉至含1 mL TRIzol的離心管中，經(jīng)相分離、RNA沉淀、RNA洗滌及溶解提取總RNA；經(jīng)檢測其純度合格后進行反轉錄，合成cDNA，-20 ℃保存。采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒在熒光定量儀上進行PCR反應。BMP-2上游引物：5′-TTTCTGGACGATTAGGAGTGC-3′，下游引物：5′-GTTTGTCGCCTTTGCGG -3′，引物長度146 bp。內參基因ACTB上游引物：5′- AGTGGAAGTGGCAAGGTCAA-3′，下游引物：5′- GGGGTTTCAAGACGTTACACC-3′，引物長度72 bp。PCR反應體系：cDNA 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)10 μL，ddH2O 4.0 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性3 s；60 ℃退火34 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算BMP-2 mRNA相對表達量。

1.4.5 股骨頭組織血管內皮生長因子(VEGF)蛋白表達 采用免疫組化法。取各組干預后第4、8周股骨頭切片，經(jīng)脫蠟至水后取出，依次浸入PBS液及3%H2O2溶液中，PBS液沖冼兩次。將切片浸入于抗原修復液中修復抗原，PBS液沖冼兩次。每張切片經(jīng)封閉后，滴加VEGF一抗、二抗孵育，DAB顯色，蘇木素復染后脫水封片。400倍顯微鏡下攝片，采用Imagepro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對其平均光密度(MOD)值進行定量分析，以MOD值表示VEGF蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 局部注射組及靜脈注射組局部感染情況 局部注射組1只于注射脂肪干細胞10天左髖部出現(xiàn)局部紅腫、皮溫高，至注射2周后消退，其他兔注射部位無感染情況。靜脈注射組局部均未出現(xiàn)感染表現(xiàn)。

2.2 各組股骨頭外形、骨密度及骨小梁變化 干預后第4周：模型組及局部注射組、靜脈注射組均可見股骨頭密度降低并呈囊性變，股骨頭形態(tài)不規(guī)則；模型組骨小梁模糊不清，股骨頭形態(tài)呈“蘑菇頭”樣改變，局部注射組、靜脈注射組均未見此改變。干預后第8周：模型組見囊性變加重，軟骨下骨塌陷，出現(xiàn)硬化帶，股骨頭變扁；局部注射組及靜脈注射組均見股骨頭硬化帶，股骨頭形態(tài)不規(guī)則，呈囊性變，但均無明顯塌陷，兩組股骨頭外形、骨密度及骨小梁變化無明顯差異。

2.3 各組干預后股骨頭組織病理學表現(xiàn)比較 干預后第4周：模型組骨小梁變細，空骨陷窩增多，造血組織減少，脂肪細胞數(shù)量明顯增多；局部注射組及靜脈注射組骨小梁稀疏，可見空骨陷窩，但數(shù)量均少于模型組，造血組織減少，脂肪細胞稍增多，兩組組織病理學表現(xiàn)無明顯差異。干預后第8周：模型組見空骨陷窩較前增多，骨小梁纖細，部分骨小梁斷裂，造血組織明顯減少，脂肪細胞增大并部分融合成團；局部注射組、靜脈注射組可見少量空骨陷窩，兩組骨小梁較前致密，脂肪細胞較前減少，造血組織較前增多，兩組組織病理學表現(xiàn)無明顯差異。

2.4 各組干預后股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量比較 干預第8周，局部注射組、靜脈注射組股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量均高于同組干預第4周(P均<0.05)。干預第4周、第8周，局部注射組、靜脈注射組股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量均高于模型組(P均<0.05)，局部注射組與靜脈注射組股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組干預后股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量比較

注：與同組干預第4周比較，*P<0.05；與模型組同時間點比較，#P<0.05。

3 討論

研究證實，壞死股骨頭的修復與干細胞的成骨和增殖能力密切相關[6]；脂肪干細胞在組織血運重建中發(fā)揮重要作用，可分泌多種細胞因子、多肽類成分等，與股骨頭壞死的發(fā)病及其損傷修復密切相關[7～9]。研究發(fā)現(xiàn)，早期SANFH在X線片上會出現(xiàn)骨小梁模糊、骨質疏松，嚴重者出現(xiàn)囊性變及骨硬化帶[11]；晚期SANFH會出現(xiàn)股骨頭變扁、塌陷等表現(xiàn)[12]。早期SANFH的病理學表現(xiàn)為空骨陷窩及脂肪細胞增多，骨小梁稀疏、變細，造血組織減少，晚期SANFH會出現(xiàn)脂肪細胞融合成團、骨小梁斷裂等表現(xiàn)[13]。本研究X線檢查結果顯示，模型組干預后第4周到第8周股骨頭逐漸出現(xiàn)變扁、塌陷，而局部注射組及靜脈注射組均未出現(xiàn)塌陷變扁表現(xiàn)；組織病理學顯示，模型組干預后第4周至第8周空骨陷窩增多，脂肪細胞數(shù)量增多、體積增大，骨小梁稀疏，而局部注射組及靜脈注射組干預后第4周空骨陷窩、脂肪細胞數(shù)量少于模型組，干預后第8周空骨陷窩、脂肪細胞數(shù)量少于干預后第4周，并且造血組織增多；局部注射組及靜脈注射組X線片及組織病理學表現(xiàn)均無明顯差異。說明股骨頭局部注射與靜脈注射移植脂肪干細胞對兔早期SANFH均有干預效果，且效果相當。

BMP是骨修復過程中的重要成骨誘導因子，對骨形成具有重要作用，BMP-2是其重要一員[14]。VEGF具有強大的促血管生成作用，被認為是最強大的促血管生成因子，血管再生對骨組織重建和修復均具有重要作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，兔SANFH股骨頭組織中VEGF、BMP-2表達均降低，而提高二者表達有利于股骨頭壞死的修復[16]。本研究結果顯示，干預后第4周、第8周，局部注射組、靜脈注射組股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量均高于模型組，而局部注射組與靜脈注射組股骨頭組織BMP-2 mRNA及VEGF蛋白相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學意義。說明靜脈注射與局部注射注射脂肪干細胞均可通過提高股骨頭組織BMP-2、VEGF表達修復病變。

關節(jié)注射是臨床治療骨關節(jié)疾病的常用手段[17]，其最常見的并發(fā)癥是注射部位局部炎癥反應引起的關節(jié)感染，主要是操作不當所致[18,19]。本研究局部注射組1只在關節(jié)注射后出現(xiàn)局部感染表現(xiàn)，考慮為注射過程操作不當引起，而靜脈注射各兔局部均未出現(xiàn)局部紅腫表現(xiàn)。證實靜脈注射移植脂肪干細胞具有操作簡便、感染發(fā)生率低等優(yōu)點。

綜上所述，靜脈注射及股骨頭局部注射移植脂肪干細胞均可通過上調BMP-2、VEGF表達而改善股骨頭血運、促進壞死骨修復，兩種方法的修復效果相當，但靜脈注射具有操作簡便、感染發(fā)生率低等優(yōu)點。