長鏈非編碼RNA MALAT1在骨肉瘤細胞中的表達變化及其對細胞侵襲能力的影響

王濤，劉一澤，馮健洲，周禹伯，申德偉，王勇

(沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院，沈陽 110024)

骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤之一，好發(fā)于長骨干骺端[1,2]。骨肉瘤患者的5年生存率為30%～75%，多數(shù)患者的最終死因為腫瘤復發(fā)或遠處轉移[3,4]。長鏈非編碼RNA (lncRNA)是真核細胞中一類轉錄本長度超過200 nt的非編碼RNA，其在X染色體沉默、 基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)冗^程中均發(fā)揮重要作用[5,6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在骨肉瘤等多種腫瘤組織中異常表達，并與腫瘤細胞侵襲、轉移有關[7]。lncRNA肺腺癌轉移相關轉錄物1(lncRNA MALAT1)在多種腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因作用，但是目前關于其在骨肉瘤中的作用鮮見報道。為此，我們于2017年9月～2018年3月進行了如下研究。

1 材料

細胞：人骨肉瘤細胞株MG-63(簡稱骨肉瘤細胞)、人成骨細胞系hFOB1.19(簡稱成骨細胞)均購自中科院上海細胞庫(將骨肉瘤細胞置于DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；成骨細胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，34 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以上兩種培養(yǎng)基中均添加10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素，待兩種細胞融合率達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化并傳代)。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR試劑盒及LipofectamineTM3000轉染試劑盒均購自美國Invitrogen公司，SYBR Master Mixture購自日本TaKaRa公司，BCA蛋白定量試劑盒購自中國江蘇凱基生物技術股份有限公司，anti-GAPDH一抗、anti-ROCK1一抗及HRP標記的羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司，Transwell小室購自美國Corning公司。主要質粒：MALAT1沉默質粒MALAT1-siRNA及其對照質粒con-siRNA、ROCK1過表達載體質粒oe-ROCK1及其對照質粒pcDNA均由廣州銳博公司設計合成。

2 方法與結果

2.1 骨肉瘤細胞與成骨細胞lncRNA MALAT1表達檢測 采用qRT-PCR法。取生長狀況良好的骨肉瘤細胞與成骨細胞，加入細胞裂解液進行裂解，參照TRIzol試劑盒說明書提取總RNA，按照Invitrogen試劑盒說明書進行逆轉錄，合成cDNA。采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒在熒光定量儀上進行PCR反應。lncRNA MALAT1上游引物：5′-GCGACGAGTTGTGCTGCTATCT-3′，下游引物：5′- ACACTGCTCTGGGTCTGCTTTT-3′； 以β-actin為內(nèi)參，β-actin上游引物：5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物：5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′。 PCR反應條件： 95 ℃預變性15 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共45個循環(huán)。以lncRNA MALAT1與β-actin條帶灰度值的比值計算lncRNA MALAT1相對表達量。結果顯示，骨肉瘤細胞與成骨細胞lncRNA MALAT1相對表達量分別為6.94±0.63、1.43±0.24，二者比較P<0.01。

2.2 lncRNA MALAT1沉默對骨肉瘤細胞侵襲能力及ROCK1蛋白表達的影響

2.2.1 骨肉瘤細胞MALAT1沉默模型建立 取生長狀況良好的骨肉瘤細胞，胰酶消化后接種于6孔板中，調整細胞密度為2×105個/孔，隨機分為MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組，培養(yǎng)24 h后分別參照LipofectamineTM3000說明書轉染MALAT1-siRNA質粒及con-siRNA質粒。轉染48 h采用qRT-PCR法(具體步驟參照2.1)檢測兩組lncRNA MALAT1表達。結果顯示MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組lncRNA MALAT1相對表達量分別為0.69±0.18、1.27±0.36，證實骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1沉默模型建立。

2.2.2 沉默MALAT1表達的骨肉瘤細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗。參照Transwell小室說明書，常規(guī)包被底部膜，水化；取轉染48 h的MALAT1沉默組和對照組細胞，調整細胞密度為2×105個/mL，分別接種于Transwell上室中。上室內(nèi)加入100 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，下室內(nèi)加入500 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，棉簽擦去Transwell小室內(nèi)部細胞，沖洗、固定、染色后倒置顯微鏡下觀察并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。每組鋪6個Transwell 小室，取其平均值。結果顯示MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組穿膜細胞數(shù)分別為(54±9)、(134±16)個，兩組比較P<0.01。

2.2.3 沉默MALAT1的骨肉瘤細胞ROCK1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取轉染48 h的MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組細胞，提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。取200 μL樣品進行SDS-PAGE，轉膜。封閉1 h后，分別加入anti-ROCK1一抗(稀釋比例為1∶2 000)或anti-GAPDH一抗(稀釋比例1∶500)，孵育過夜；次日加入HRP標記的羊抗兔二抗(稀釋比例為1∶2 000)，孵育1 h。參照ECL試劑盒說明書行電化學發(fā)光檢測，采用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以ROCK1與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值計算ROCK1蛋白相對表達量。 結果顯示，MALAT1沉默組和MALAT1非沉默組ROCK1蛋白相對表達量分別為0.36±0.07和1.06±0.11，兩組比較P<0.01。

2.3 ROCK1過表達對骨肉瘤細胞侵襲能力的影響

2.3.1 過表達ROCK1的骨肉瘤細胞模型建立 胰酶消化后接種于6孔板中，調整細胞密度為2×105個/孔。將骨肉瘤細胞隨機分為MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組，培養(yǎng)24 h后分別參照LipofectamineTM3000說明書轉染MALAT1-siRNA質粒、con-siRNA質粒、MALAT1-siRNA+oe-ROCK1質粒、MALAT1-siRNA+pcDNA質粒。轉染48 h采用Western blotting法(具體步驟參照2.2.3)檢測四組ROCK1蛋白相對表達量。結果顯示，MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組ROCK1蛋白相對表達量分別為0.43±0.11、1.21±0.17、1.86±0.27、0.47±0.13。對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組(P均<0.01)；對照組與MALAT1沉默+ROCK1過表達組比較、MALAT1沉默組與MALAT1沉默+ROCK1對照組比較P均>0.05。證實過表達ROCK1的骨肉瘤細胞模型建立。

2.3.2 過表達ROCK1的骨肉瘤細胞侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲實驗(具體步驟參照2.2.2)檢測四組細胞侵襲能力。結果顯示，MALAT1沉默組、對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組、MALAT1沉默+ROCK1對照組穿膜細胞數(shù)分別為(52±7)、(128±14)、(196±14)、(56±7)個；對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組(P均<0.01)；對照組與MALAT1沉默+ROCK1過表達組比較、MALAT1沉默組與MALAT1沉默+ROCK1對照組比較P均>0.05。

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，非編碼RNA在表觀遺傳調控中扮演了重要角色[8]。非編碼RNA可分為lncRNA和微小RNA，lncRNA是指長度超過200 nt的一大類轉錄本[9]。MALAT1位于人染色體11q13.1，最初發(fā)現(xiàn)時被認為是肺癌侵襲轉移相關的標志物之一[10]。Cai等[11]報道，lncRNA MALAT1在骨肉瘤中發(fā)揮癌基因的作用，并可作為骨肉瘤治療的靶基因。Liu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1在小細胞肺癌組織及細胞系中表達升高，下調其表達可抑制肺癌ACC-LC-319細胞的侵襲能力。Wang等[13]在一項胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，lncRNA MALAT1可通過調控SF2/ASF 通路促進胃癌細胞SGC-7901增殖。Li等[14]報道，lncRNA MALAT1在胰腺癌組織中表達升高，其表達上調可促進胰腺癌的進展。本研究結果顯示，骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1相對表達量高于成骨細胞，提示MALAT1在骨肉瘤的發(fā)生過程中可能發(fā)揮癌基因的作用。本研究MALAT1沉默組MALAT1相對表達量、細胞侵襲能力均低于對照組，提示沉默骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1表達可降低其侵襲能力，初步證實lncRNA MALAT1與骨肉瘤細胞侵襲有關。

ROCK1是一種小分子G蛋白[15]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1參與了包括結直腸癌、骨肉瘤等腫瘤的局部浸潤和淋巴結轉移[16,17]。Luo等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1在甲狀腺癌組織中表達升高并與腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處器官轉移、侵及甲狀旁腺及血管等密切相關，上調其表達可提高甲狀腺癌細胞的侵襲能力。Wang等[19]報道，ROCK1在骨肉瘤中表達升高，通過上調miR-335、下調ROCK1表達可抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力。既往研究發(fā)現(xiàn)，ROCK1在骨肉瘤組織中表達增高，高表達的ROCK1與骨肉瘤患者預后不良密切相關，而抑制ROCK1表達可降低骨肉瘤細胞的侵襲能力[19～21]。本研究結果顯示，對照組、MALAT1沉默+ROCK1過表達組ROCK1蛋白表達及細胞侵襲能力均高于MALAT1沉默組、MALAT1沉默+ROCK1對照組；提示在lncRNA MALAT1沉默的骨肉瘤細胞中轉染ROCK1過表達載體質粒oe-ROCK1后，骨肉瘤細胞的侵襲轉移能力重新得到了加強，初步證實lncRNA MALAT1對骨肉瘤細胞侵襲能力的調控作用是通過調控ROCK1表達實現(xiàn)的。

綜上所述，骨肉瘤細胞lncRNA MALAT1表達升高，lncRNA MALAT1可能通過調控ROCK1表達而參與骨肉瘤細胞侵襲。骨肉瘤的侵襲轉移是一個涉及多通路多因子多機制的復雜的生物學行為過程，本研究僅初步探討了lncRNA MALAT1在骨肉瘤細胞MG-63中的表達及其對ROCK1介導的MG-63細胞侵襲轉移的影響，而lncRNA的作用機制比較復雜，MALAT1參與ROCK1介導的骨肉瘤細胞侵襲轉移的具體作用機制還有待于進一步深入研究。