索拉非尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療急性髓細(xì)胞白血病療效及對(duì)患者干細(xì)胞NF-κB及FLT3蛋白表達(dá)影響

于 婷， 鄭 立,袁 穎

四川省廣元市中心醫(yī)院血液內(nèi)科(廣元 628000)

主題詞 白血病, 髓樣, 急性/治療 @索拉非尼 阿糖胞苷 @蛋白表達(dá)

急性髓細(xì)胞白血病 (Acute myeloid leukemia,AML)是髓系造血干細(xì)胞的克隆增殖導(dǎo)致的造血功能受損繼而出現(xiàn)白血病細(xì)胞器官浸潤(rùn)、粒細(xì)胞缺乏等惡性血液腫瘤。AML在35歲以上成人中發(fā)病率最高[1]，病死率占癌癥死亡的1.6%[2],隨著腫瘤靶向治療技術(shù)的不斷提高，抑制AML異常突變基因治療研究逐漸增多，F(xiàn)LT3基因突變是AML最常見的基因突變，F(xiàn)LT3基因突變的陽性表達(dá)常預(yù)示預(yù)后不良[3]，NF-κB是一類參與炎癥、免疫、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)行為中基因調(diào)節(jié)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用。索拉非尼是首個(gè)口服多靶點(diǎn)激酶抑制劑, 具有多靶點(diǎn)控制、廣譜、易于聯(lián)合用藥，患者耐受性好等優(yōu)點(diǎn)[4]，聯(lián)合化療在治療難治性和移植后復(fù)發(fā)的AML有較大的優(yōu)勢(shì)[5]。目前關(guān)于索拉菲尼聯(lián)合化療對(duì)FLT3、NF-κB表達(dá)的研究較少，此背景下，對(duì)我科62例AML患者采用索拉菲尼聯(lián)合小劑量Ara-C治療，觀察臨床療效以及對(duì)FLT3、NF-κB表達(dá)的影響，報(bào)道如下。

資料與方法

1 一般資料 選取2016年1月至2017年2月我院血液科收治的62例經(jīng)AML患者。復(fù)發(fā)難治性AML診斷依據(jù)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì)修訂的AML中國(guó)診療指南(2011年版)。AML患者形態(tài)學(xué)分型參考FAB分型。所有患者均經(jīng)我院細(xì)胞遺傳學(xué)、骨髓形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)(MICM)、免疫學(xué)等檢測(cè)[6]確診。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者隨機(jī)分為兩組，每組31例，研究組男16例，女15例，年齡(36.82±6.97)歲，BMI(23.58±4.25)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型7例，M2型15例， M4型4例，M5型5例，初診16例，復(fù)發(fā)15例；對(duì)照組男18例，女13例，年齡(37.26±7.05)歲，BMI(24.97±4.08)Kg/m2，F(xiàn)AB分型：M1型6例，M2型13例， M4型6例，M5型6例，初診14例，復(fù)發(fā)17例；兩組基線有可比性(P>0.05)。

2 方 法

2.1 治療方法：研究組患者于進(jìn)食前1 h或進(jìn)食后2 h口服索拉非尼片(德國(guó)拜耳)400 mg，2次/d，連續(xù)服用35 d，治療過程中患者若出現(xiàn)不耐受可降低服用次數(shù)至1次/d或隔日一次;阿糖胞苷注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字H20055128)50 mg皮下注射,治療14 d。對(duì)照組采用DA誘導(dǎo)化療方案：柔紅霉素(20 mg/支，國(guó)藥準(zhǔn)字H33020925)60 mg溶于250 ml的0.9%NaCl溶液中快速靜點(diǎn)，1次/d,連續(xù)用藥3 d，Ara-C200 mg溶于500 ml 5%GS溶液中緩慢靜滴，連續(xù)用藥7 d。

2.2 副作用觀察及支持治療：每日5%NaHCO2250 ml靜脈滴注堿化尿液,阿扎司瓊注射液2 ml化療前后靜脈注射預(yù)防嘔吐，強(qiáng)水化治療(每日靜脈液體入量2500～3000 ml/m2)。中性粒細(xì)胞缺乏(ANC<0.5×109/L[7])時(shí)入住層流病室，每日皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子150～300 μg,無菌飲食，并加強(qiáng)口腔、鼻腔、外耳道、皮膚護(hù)理和肛周護(hù)理及中心靜脈置管護(hù)理。每3 d檢查一次血常規(guī)，如Hb<60 g/L，給予輸注紅細(xì)胞懸液，若Plt<20×109/L 時(shí)，給予輸注單采血小板懸液。當(dāng)出現(xiàn)中性粒細(xì)胞缺乏或發(fā)熱時(shí)，給予抗感染治療，參照2012年中國(guó)中性粒細(xì)胞缺乏伴發(fā)熱患者抗菌藥物臨床應(yīng)用指南[8]，抗真菌治療參考 2013 年血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則[9]。

2.3 NF-κB檢測(cè)方法：所有患者均于治療前后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行白血病干細(xì)胞的分選和純化。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h，Western Bloting法檢測(cè)NK-κB的表達(dá)。

2.4 FLT3基因檢測(cè)方法：采用多聚酶鏈反應(yīng)PCR+單鏈構(gòu)象多態(tài)性SSCP方法患者治療前、后新鮮骨髓中的FLT3基因及FLT3-ITD基因突變。所有患者均于治療前、后采集骨髓5 ml，置入抗凝試管，PBS液洗滌，應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)和流式細(xì)胞儀進(jìn)行白血病干細(xì)胞的分選和純化。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)骨髓單個(gè)核細(xì)胞48 h。總DNA使用全血基因組提取試劑盒進(jìn)行提取，并測(cè)定A260/A280，判斷DNA的濃度和純度。采用去離子水稀釋終樣品至500 ng/μl，備用。根據(jù)FLT3突變區(qū)的一般情況，將檢測(cè)上游引物、下游引物及擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別設(shè)計(jì)為5’-GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’、5’-CTTCAGCATTTTGACGGCAACC-3’及329bp。采用PCR試劑盒，20 pmol/μl上下游引物+500 ng基因組DNA，去離子水定容至50 μl。經(jīng)過30個(gè)循環(huán)的預(yù)變性、變性、退火、延伸過程，取15 μl反應(yīng)產(chǎn)物，運(yùn)用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果分析。

3 觀察指標(biāo) 療效評(píng)價(jià)：治療結(jié)束2周進(jìn)行骨髓穿刺復(fù)查骨髓細(xì)胞形態(tài)，參照血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[10]，CR：未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)所致的癥狀和體征;Hb≥100 g/L(男)或Hb≥90 g/L(女及兒童)，ANC≥1.5×109g/L，血小板≥100×109g/L，外周血未發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞；原粒細(xì)胞Ⅰ型 +Ⅱ型、原始細(xì)胞+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞≤5%，紅細(xì)胞及巨核細(xì)胞系正常。PR:5%<骨髓原粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞)≤20%，臨床、外周血象中有一項(xiàng)未達(dá)完全緩解者。NR：骨髓原粒細(xì)胞Ⅰ型+Ⅱ型(原始單核+幼稚單核細(xì)胞或原始淋巴細(xì)胞+幼稚淋巴細(xì)胞)>20%，臨床癥狀未改善，外周血仍存在白血病細(xì)胞。安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)：依據(jù)WHO急性及亞急性化療藥物毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定不良反應(yīng)，0(無)、Ⅰ(輕度)、Ⅱ(中度)、Ⅲ(重度)、Ⅳ(威脅患者生命)。

結(jié) 果

1 療效評(píng)價(jià) 研究組22例CR，7例PR，2例未緩解，對(duì)照組16例CR，9例PR，6例未緩解。兩組PR例數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；研究組CR比例高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；研究組NR比例低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2 安全性評(píng)價(jià) 研究組2例中性粒細(xì)胞缺乏，1例血小板減少、1例貧血、1例消化道不良反應(yīng)、2例感染，均為Ⅰ-Ⅱ級(jí)不良反應(yīng)，不良反應(yīng)率22.58%，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且研究組粒缺時(shí)間(12.94±2.17)d，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

3 FLT3、NK-κB在不同治療組治療前后的差異 兩組FLT3、NK-κB在治療前表達(dá)無差異(P>0.05)，研究組治療后FLT3、NK-κB的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，表達(dá)強(qiáng)度低于對(duì)照組(P<0.05)，見表3。

表1 兩組療效評(píng)價(jià)[例(%)]

表2 兩組安全性評(píng)價(jià)

表3 不同治療組治療前后FLT3、NK-κB表達(dá)的差異

討 論

FLT3是對(duì)造血免疫系統(tǒng)具有重要意義的受體絡(luò)氨酸激酶，在正常造血系統(tǒng)表達(dá)于早期造血祖細(xì)胞、樹突細(xì)胞和大腦、胎盤等組織，過度表達(dá)于AML的各個(gè)FAB分型，以及B細(xì)胞ALL和部分T細(xì)胞ALL。35%AML患者存在FLT3基因突變，F(xiàn)LT3+患者對(duì)常規(guī)化療不敏感，療效差，誘導(dǎo)化療緩解率低、緩解維持時(shí)間短、極易復(fù)發(fā)，部分接受異體造血干細(xì)胞移植后仍可出現(xiàn)復(fù)發(fā)，F(xiàn)LT3基因突變常提示預(yù)后不良。

索菲拉尼是一種小分子、多靶點(diǎn)多激酶抑制劑，對(duì)存在細(xì)胞內(nèi)和表面的Raf激酶、VEGFR-2、VEGFR-3等可顯著抑制，阻斷腫瘤新生血管的形成間接抑制腫瘤，同時(shí)索菲拉尼還可以通過抑制RAF等信號(hào)通路直接抑制腫瘤生長(zhǎng)。索菲拉尼最初用于腎癌、肝癌的治療。本研究組患者采用索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷治療AML初治和復(fù)發(fā)患者完全緩解22例，CR率70.97%，且在誘導(dǎo)化療期間不良反應(yīng)少，雖然中性粒細(xì)胞缺乏發(fā)生率較高，但是明顯低于對(duì)照組，且中性粒細(xì)胞缺乏時(shí)間明顯短于對(duì)照組，其它不良反應(yīng)均為骨髓抑制和消化道副作用，且不良反應(yīng)分級(jí)均為Ⅰ-Ⅱ級(jí)，不良反應(yīng)率22.58%，總體低于對(duì)照組?？赡芘c研究組方案減少了阿糖胞苷使用劑量從而降低骨髓抑制程度有關(guān)。索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷不僅可以提高臨床緩解率，而且可以降低不良反應(yīng)，提高患者治療耐受度，增強(qiáng)治療效果。其次我們研究了不同治療方案對(duì)AML患者FLT-3以及NK-κB表達(dá)的影響，可以看出兩組治療后FLT-3、NK-κB表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)，證明兩種化療方案均對(duì)FLT-3、NK-κB表達(dá)都可產(chǎn)生一定的影響，但索菲拉尼聯(lián)合小劑量阿糖胞苷對(duì)FLT-3、NK-κB表達(dá)的影響程度更大，研究組方案對(duì)FLT-3基因突變AML患者治療效果優(yōu)于對(duì)照組，同時(shí)也提示我們索菲拉尼可能通過抑制FLT-3基因表達(dá)抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的機(jī)制。綜上，聯(lián)合索菲拉尼和小劑量阿糖胞苷治療可明顯降低FLT3基因的表達(dá)，提高AML臨床緩解率高，且對(duì)復(fù)發(fā)AML患者有效。