人結(jié)直腸癌中兩種新分子生物標(biāo)記物的篩選

許 特，王 筠，趙宋禮，李延鵬，劉興木，鐘 姍，彭紅瑜，屈軍樂(lè)，盛司潼，王曉梅

1)深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳518060； 2)深圳大學(xué)光電工程學(xué)院，光電子器件與系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060；3)佛山市三水區(qū)人民醫(yī)院，廣東佛山 528100； 4)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣東汕頭 515065；5)深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518060

結(jié)直腸癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居惡性腫瘤第3位[1]. 近年來(lái)，人們飲食結(jié)構(gòu)和生存環(huán)境隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的高速發(fā)展而改變, 結(jié)直腸癌在中國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]，致死率高居惡性腫瘤排名榜第5位[3]. 結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與大多數(shù)腫瘤類似，可分為異常增生、原位腫瘤、惡性侵潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移等數(shù)個(gè)病程階段.當(dāng)前，對(duì)結(jié)直腸癌的治療策略主要是確診后的外科手術(shù)、放射治療和化療[1]，但此時(shí)癌癥多已處于中晚期，可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，如肝臟[4]、大腦或肺部等[5]，故大部分患者已不能通過(guò)以上方案有效治愈，5年內(nèi)存活率不到60%. 因此，如果在癌癥初發(fā)期就能確診并采取有效的治療手段，病人存活率無(wú)疑會(huì)大幅提升. 但迄今為止，結(jié)直腸癌的早期診斷依然處于瓶頸階段. 對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的深入研究和分子層面上的靶向標(biāo)志物篩選已成為科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn).

TAF1L(TATA-box binding protein associated factor 1 like，又稱TAF(Ⅱ)210)基因主要生物學(xué)功能與同源物TAF1類似[6-7].TAF1基因主要作為T(mén)ATA box結(jié)合蛋白，參與核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)聚合酶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程，是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物TFⅡD的重要組成部分[8-9]. 據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，TAF1L為體細(xì)胞突變最多(約為10.6%)的基因之一，在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，TAF1L與TAF1基因的突變能激發(fā)體細(xì)胞突變. 胃癌、結(jié)直腸癌與TAF1L以及其同源物TAF1的突變有關(guān)[6]，但它們?cè)诎┌Y發(fā)生過(guò)程中的分子作用機(jī)制并不清楚. stomatin-like protein 1(STOML1)基因主要存在于細(xì)胞囊泡和細(xì)胞膜，可調(diào)節(jié)離子通道活性[11]，參與調(diào)控細(xì)胞膜系統(tǒng)上的離子通道外圍膜蛋白，調(diào)節(jié)胞外離子進(jìn)出細(xì)胞速率[12]. STOML1蛋白在游離的N端和C端上有特殊的結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)與其他調(diào)節(jié)因子結(jié)合參與原癌基因的退化調(diào)控[13]. 此外，前期研究也發(fā)現(xiàn)，STOML1可能參與口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[14].TAF1L和STOML1基因可能在癌癥發(fā)病機(jī)制的調(diào)控領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用.因此，為進(jìn)一步探究這兩個(gè)基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的生理與病理功能，本研究利用優(yōu)化的多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在高通量微陣列組織芯片上觀察、比較TAF1L和STOML1基因在癌組織與相匹配的癌旁正常組織上的分布及表達(dá)差異；分析其在結(jié)直腸癌不同臨床及病理分期的表達(dá)變化，判斷它們是否與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并評(píng)估可否作為新的結(jié)直腸癌的分子標(biāo)志物，以輔助結(jié)直腸癌的早期診斷、療效評(píng)估及預(yù)后判定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本

微陣列組織芯片(CO803a，US Biomax)購(gòu)于西安艾麗娜生物科技有限公司，共有結(jié)直腸組織80例，其中，腺癌39例、印戒細(xì)胞癌1例、相匹配的癌旁結(jié)腸組織40例.

1)根據(jù)臨床分期分類．結(jié)直腸癌臨床Ⅰ期組織4例、Ⅱ期組織21例、Ⅲ期組織15例．

2)根據(jù)病理分型分類．低分化組織14例、中分化組織12例、高分化組織11例．

3)按照tumor-lymph node-metastasis(TNM)分期分類．T2期組織切片4例，均為N0期(因不包含淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織)；T3期組織切片23例，其中，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的11例，為N0期；出現(xiàn)了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的12例，均為N1期；T4期組織切片13例，3例發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其中，2例為N1期、1例為N2期.所以，從組織芯片上共觀察分析N0期癌組織25例，N1期癌組織15例. 因?yàn)樵摻Y(jié)直腸癌組織芯片上缺少T1期組織，故此次T1期組織不納入統(tǒng)計(jì)范圍. 由于N2期的組織切片樣本數(shù)量太少，無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，故N2期也不納入此分析.另外，所有結(jié)直腸癌組織切片中均未出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況，都處于M0期，故不進(jìn)行M分期分析.

1.2 多重免疫組織化學(xué)染色

運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)室改良的多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在同一微陣列組織芯片上，先進(jìn)行TAF1L抗體染色，顯微鏡拍照，隨后芯片脫色，再進(jìn)行STOML1抗體染色，并記錄特異性信號(hào)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì).

1.2.1 組織切片首次染色處理

組織切片首次染色步驟為：① 將石蠟包埋的組織芯片置于60 ℃烘箱2 h；② TO透明劑脫蠟10 min后，梯度酒精依次浸泡各5 min，PBS緩沖液清洗3遍，每次5 min；③ 將芯片置于抗原修復(fù)蒸鍋加熱30 min，自然冷卻至室溫，PBS清洗3遍，每次5 min；④ 一抗孵育過(guò)夜；⑤ PBS清洗3遍，每次5 min；⑥ 滴加PV9000反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min，PBS清洗3遍，每次5 min；⑦ 滴加PV9000增強(qiáng)酶標(biāo)抗兔IgG聚合物，室溫孵育20 min, PBS清洗3遍，每次5 min；⑧ AEC檢測(cè)試劑盒顯色，將組織芯片置于蘇木素染液中染色， 且自來(lái)水流緩沖10 min； ⑨甘油明膠封片.

1.2.2 組織切片脫色與復(fù)染處理

將組織切片置于60 ℃水浴鍋中浸泡10 min，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶解3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，AEC)染色，PBS緩沖液清洗3遍，每次5 min.后續(xù)的再次染色操作自抗原修復(fù)始，余同第1次染色步驟.

1.2.3 圖像采集與數(shù)據(jù)分析

利用蔡司顯微鏡進(jìn)行掃描拍照，ZEN成像軟件觀測(cè)陽(yáng)性信號(hào). 綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比等參數(shù)，依據(jù)文獻(xiàn)[15-17]，采用如下標(biāo)準(zhǔn)：

1)染色強(qiáng)度．強(qiáng)(深紅棕色)計(jì)3分；中等(紅)計(jì)2分；弱(淺紅)計(jì)1分；無(wú)著色(藍(lán))計(jì)0分.

2)陽(yáng)性細(xì)胞率．陽(yáng)性細(xì)胞(染色為紅色的細(xì)胞)所占總細(xì)胞數(shù)百分比>75%計(jì)4分；51%～75%計(jì)3分；26%～50%計(jì)2分；6%～25%計(jì)1分；≤5%計(jì)0分.

總積分=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率

(1)

總積分≥4分，判定為陽(yáng)性；總積分<4分，判定為陰性. 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0～1分視為陰性(-)；2～3分為可疑陽(yáng)性染色(±)；4～5分為陽(yáng)性染色(+)；6～7分為中等陽(yáng)性染色(++)；≥8分為強(qiáng)陽(yáng)性染色(+++).

2 結(jié)果與分析

2.1 TAF1L蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌組織芯片上的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色的陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)紅色或棕紅色著色信號(hào). 圖1染色結(jié)果顯示，在癌旁組織中，染色結(jié)果為陰性，而在結(jié)直腸組織中，染色為中等陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性. TAF1L主要在胞漿中表達(dá)、部分在細(xì)胞核中表達(dá)，如圖1(a)和(b). 此外，圖1(c)染色綜合評(píng)分結(jié)果表明，TAF1L在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)呈顯著上調(diào)，P<0.000 1. 由此說(shuō)明，TAF1L蛋白的高表達(dá)很可能與結(jié)直腸癌的病變直接相關(guān).

圖1 免疫組織化學(xué)染色顯示TAF1L蛋白質(zhì)在癌旁組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況Fig.1 TAF1L protein expression in the paratumor and colorectal cancer with immunohistochemistry

2.2 TAF1L蛋白在結(jié)直腸癌患者不同臨床參數(shù)與病理分期、分級(jí)間的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

為分析TAF1L蛋白在結(jié)直腸癌組織上的表達(dá)與其臨床參數(shù)之間的關(guān)系，利用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)對(duì)TAF1L蛋白在結(jié)直腸癌不同臨床分期、病理分級(jí)、TNM分期間的表達(dá)水平進(jìn)行觀察，結(jié)果見(jiàn)圖2至圖4，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 結(jié)腸癌組織芯片參數(shù)及TAF1L蛋白在結(jié)腸癌的表達(dá)情況

2.2.1 TAF1L蛋白在結(jié)直腸癌不同臨床分期中的表達(dá)情況

運(yùn)用One Way-ANOVE方法對(duì)癌旁正常組織與結(jié)直腸癌不同臨床分期組織進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)．由圖2可見(jiàn)，TAF1L在結(jié)直腸癌不同臨床分期組織中表達(dá)均高于癌旁正常組織；臨床Ⅱ期及Ⅲ期癌組織染色顯著高于癌旁正常組織(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖2(a)至(d).分析表明，TAF1L蛋白的表達(dá)水平隨病程惡化而增高，但不同臨床分期間的陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 見(jiàn)圖2(e).

2.2.2 TAF1L蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌不同病理分級(jí)中的表達(dá)

圖3結(jié)果顯示，TAF1L蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌不同病理分級(jí)中的染色強(qiáng)度均高于癌旁正常組織.在高分化和中分化的癌組織中，表達(dá)顯著上調(diào)，分別為P<0.05和P<0.01. 而在低分化癌組織中，P>0.05，雖表達(dá)上調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2.3 TAF1L蛋白在結(jié)直腸癌TNM分期中的表達(dá)

在結(jié)直腸癌組織TNM分期中，TAF1L陽(yáng)性表達(dá)率呈增加趨勢(shì).對(duì)于TNM-N分期，相較癌旁正常組織，N0和N1組均顯著增加，分別為P<0.01和P<0.001， 見(jiàn)圖4(b)、(c)和(g)，但N0和N1組間增加不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 對(duì)于TNM-T分期，相比癌旁正常組織，TAF1L在T2、T3和T4期組織表達(dá)均有不同程度增加，T3期最為顯著(P<0.000 1)， T2和T4均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， 見(jiàn)圖4(d)、(f)和(h).

此外，對(duì)組織芯片中患者的年齡和性別進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)與One Way-ANOVE半定量檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，各組數(shù)據(jù)相差較小.表明TAF1L蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌上的表達(dá)與患者的年齡及性別關(guān)系不大.

圖2 TAF1L蛋白在癌旁組織和結(jié)直腸癌不同臨床分期中的免疫組織化學(xué)染色Fig.2 TAF1L protein expression at different clinical stages of colorectal cancer with immunohistochemistry

圖3 TAF1L蛋白質(zhì)在癌旁組織和結(jié)直腸癌不同病理分級(jí)中的免疫組織化學(xué)染色Fig.3 TAF1L protein expression at different pathological grades of paratumor and colorectal cancer with immunohistochemistry

圖4 TAF1L蛋白在癌旁組織和結(jié)直腸癌TNM分期中的免疫組織化學(xué)染色Fig.4 TAF1L protein expression at paracancer and TNM of colorectal cancer with immunohistochemistry

2.3 STOML1蛋白在結(jié)直腸癌組織芯片上的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，STOML1主要在細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)表達(dá)，部分陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞核中，見(jiàn)圖5(a). 統(tǒng)計(jì)方法同上述TAF1L. 圖5染色綜合評(píng)分結(jié)果表明，與癌旁正常組織比對(duì)，STOML1在結(jié)直腸癌組織表達(dá)無(wú)明顯差異.因此，不再進(jìn)一步分析STOML1在結(jié)直腸癌不同臨床分期、病理分級(jí)、TNM分期以及性別、年齡等疾病參數(shù)方面的表達(dá)差異性.

圖5 STOML1蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌組織及相匹配的癌旁組織中的表達(dá)情況Fig.5 STOML1 protein expression in paratumor and colorectal cancer with immunohistochemistry

3 討 論

本研究選用微陣列組織切片作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，克服了腫瘤組織標(biāo)本大樣本群采集受限和高通量組織切片多源性所致的難以標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)判等缺陷. 并將本課題組優(yōu)化的多重免疫組織化學(xué)染色技術(shù)和計(jì)算機(jī)數(shù)字掃描用于微陣列組織切片的染色、觀察、記錄和分析，極大地提高了組織芯片利用效率和應(yīng)用范圍.

尋找新的、精準(zhǔn)的、有效的分子生物靶標(biāo)，目前是結(jié)直腸癌診治研究和治療的重點(diǎn). 近年來(lái)，隨著二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，一些研究揭示在腫瘤的病變進(jìn)程中可伴隨TAF1L基因突變[18].TAF1L基因可通過(guò)突變導(dǎo)致腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，包括在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性型的胃癌和結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用[7].前期研究顯示，TAF1的Thr55位點(diǎn)磷酸化p53，導(dǎo)致p53從p21啟動(dòng)子解離，進(jìn)而使DNA損傷修復(fù)反應(yīng)中的p53依賴性轉(zhuǎn)錄失活[19]. 另有報(bào)道指出，TAF1可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)，與細(xì)胞周期相關(guān)，并在基因毒性應(yīng)激中具有細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用[20-22].前期通過(guò)RNA-Seq數(shù)據(jù)中分析確認(rèn)了TAF1L基因在口腔鱗狀細(xì)胞癌中存在突變累積[14].本研究通過(guò)多重免疫組織化學(xué)染色法、電子數(shù)字掃描和軟件分析，結(jié)果表明，與癌旁組織相比較，TAF1L蛋白質(zhì)在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1). 逐步分析還發(fā)現(xiàn)，TAF1L的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的臨床分期、病理分級(jí)和TNM分期等病變程度均具有一定的相關(guān)性.在結(jié)直腸癌不同臨床分期組織中其表達(dá)水平均高于癌旁正常組織，臨床Ⅱ期及Ⅲ期癌的組織陽(yáng)性信號(hào)染色顯著高于癌旁正常組織(P<0.05與P<0.01)； 在結(jié)直腸癌不同病理分級(jí)中其陽(yáng)性信號(hào)均高于癌旁正常組織，分別在高分化和中分化的癌病灶表達(dá)呈顯著性上調(diào)(P<0.05與P<0.01). 但在低分化癌變組織中，雖也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 在結(jié)直腸癌TNM分期中，相比癌旁正常組織，N0和N1組均呈顯著性增加，分別為P<0.01和P<0.001， 但N0和N1組間增加不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 對(duì)于TNM-T分期，相比癌旁正常組織，TAF1L在T2、T3和T4期組織表達(dá)均不同程度增加，在T3期表現(xiàn)為最為顯著(P<0.000 1)， T2和T4差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).由此，進(jìn)一步確定了TAF1L基因的高表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中具有重要的生理與病理意義.本研究無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的部分結(jié)果可能是由于個(gè)別組別的樣本量小，導(dǎo)致平均值偏大，使變化趨勢(shì)不明顯或無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；或因各個(gè)組別的樣本量不勻衡，有極少組別樣本缺失，使一些數(shù)據(jù)無(wú)法參與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理. 例如，各組臨床參數(shù)之間經(jīng)分析，TAF1L雖有高表達(dá)趨勢(shì)，但與病變程度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TAF1L基因有可能是結(jié)直腸癌的致病基因或參與調(diào)控病變發(fā)展的關(guān)鍵因子.需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物模型，深挖其生物學(xué)意義和作為結(jié)直腸癌診治標(biāo)志物的潛在能力.

本研究重點(diǎn)檢測(cè)、觀察、分析了TAF1L與STOML1兩個(gè)蛋白質(zhì)組織原位表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中的改變，以及其與結(jié)直腸癌臨床分期、病理分級(jí)和TNM分期等相關(guān)病程特征指標(biāo)的可能關(guān)聯(lián)，預(yù)測(cè)評(píng)估它們作為該腫瘤精準(zhǔn)診治的生物靶標(biāo)的可能性，并為進(jìn)一步完善結(jié)直腸癌的致病機(jī)制提供了新的分子病理依據(jù).