內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)活性氧及其機(jī)制

孫晶 王巍 田野 田振

[摘要] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)精細(xì)的膜系統(tǒng)，交織分布于細(xì)胞質(zhì)中，主要負(fù)責(zé)蛋白合成、修飾、加工及新生肽鏈的折疊、運(yùn)輸?shù)?。改變ER的氧化環(huán)境及其內(nèi)Ca2+含量會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）誘導(dǎo)的活性氧（ROS）的產(chǎn)生。其中，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶、谷胱甘肽/谷胱甘肽脫水酶、NADPH氧化酶4、細(xì)胞色素P450酶、Ca2+及線粒體呼吸鏈蛋白發(fā)揮著重要的作用。本文回顧了持續(xù)的ERS和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引發(fā)的ROS級聯(lián)及其相關(guān)機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；活性氧；機(jī)制

[中圖分類號] R363 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）06（a）-0042-04

[Abstract] Endoplasmic reticulum（ER） is the major site of calcium storage and protein folding. Alterations in the oxidative environment of ER and also intra-ER Ca2+ can cause the production of ERS-induced ROS. PDI， ERO-1， GSH， Nox4， CYP， Ca2+ and mitochondrial electron transport chain proteins play crucial roles in ERS-induced production of ROS. Here， persistent ERS and protein misfolding-initiated ROS cascades and their related mechanisms will be reviewed.

[Key words] Endoplasmic reticulum stress； Reactive oxygen species； Mechanism

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是所有真核細(xì)胞分泌途徑的主要細(xì)胞器，在細(xì)胞中執(zhí)行多種多樣的功能，包括蛋白質(zhì)生物合成、折疊、易位和翻譯后修飾（包括糖基化、二硫鍵形成等）[1]。不同的蛋白質(zhì)完成正確折疊和組裝的時(shí)間不同，在指定時(shí)間內(nèi)不能正確折疊的蛋白質(zhì)會通過泛素-蛋白酶體系進(jìn)行ER相關(guān)降解（ER-associated degradation，ERAD）[2]。許多分子伴侶和酶通過ERAD共同作用來限制ER工作量以促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊并阻止其聚集[3]。當(dāng)ER工作量過多時(shí)，蛋白質(zhì)不能達(dá)到其天然折疊狀態(tài)，導(dǎo)致未折疊蛋白質(zhì)在ER腔中聚集，這種情況稱為ER應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），它會擾亂細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。ERS發(fā)生后，細(xì)胞會啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）以恢復(fù)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[4]。在長期嚴(yán)重的ERS下，UPR不再發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，而開始產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用（包括凋亡）。許多證據(jù)表明，活性氧（ROS）的產(chǎn)生與ERS之間存在直接聯(lián)系[5-6]。UPR期間介導(dǎo)ROS生成的主要酶組分是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶（endoplasmic reticulum oxidoreductin-1，ERO-1）和NADPH氧化酶復(fù)合物（特別是Nox4）。此外，線粒體電子轉(zhuǎn)運(yùn)酶也會誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生[7]。本文將闡述持續(xù)的ERS和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，引發(fā)ROS級聯(lián)反應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制。

1 二硫鍵形成過程中ERS誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生

PDI是ER中必不可少的二硫鍵形成酶。它是細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一，存在于動物、植物和真菌中。PDI和ERO-1驅(qū)動ER中蛋白質(zhì)二硫鍵的形成。ERO-1借助黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）依賴性反應(yīng)將電子從PDI經(jīng)歷幾種硫醇-二硫化物交換反應(yīng)轉(zhuǎn)移到分子氧（O2），氧的不完全還原導(dǎo)致超氧陰離子自由基的形成，其可以轉(zhuǎn)化為過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）或其他ROS，引起ER中蛋白折疊誘發(fā)的氧化應(yīng)激。該電子轉(zhuǎn)移表明ERO-1可以促進(jìn)ER內(nèi)的ROS形成，涉及ERO-1的二硫鍵形成過程對細(xì)胞中ROS的總產(chǎn)量有顯著貢獻(xiàn)。如上所述，ERO-1與ER中的蛋白質(zhì)折疊具有很強(qiáng)的相關(guān)性，并且可以觸發(fā)ROS產(chǎn)生、促成ERS。

2 Nox4介導(dǎo)的ERS誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生

在眾多生成ROS的途徑中，NADPH氧化酶發(fā)揮著主要的作用。NADPH氧化酶是具有7個(gè)成員的蛋白質(zhì)家族，包括Nox 1-5和Duox 1和2[8]，其中與ER最具有相關(guān)性的亞型是Nox4。除ER外，線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞骨架等其他位置也存在Nox4。Nox4也涉及ERS誘導(dǎo)的ROS生成。研究表明，與p22phox亞基相關(guān)的Nox4使用NADH或NADPH（作為電子供體）來進(jìn)行氧還原產(chǎn)生超氧陰離子[9]。在由氧合脂質(zhì)產(chǎn)物7-酮膽固醇或衣霉素引起的ERS狀態(tài)下，人血管平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo)Nox4表達(dá)增多，ROS的產(chǎn)生也隨之增加[10]。而沉默Nox4可以減少UPR誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并且還負(fù)責(zé)促凋亡和促適應(yīng)信號，即伴侶的表達(dá)[11]。此外，在ERS相關(guān)疾病方面，已有研究闡述了在各種ERS誘導(dǎo)的疾病狀況下Nox4在ROS生產(chǎn)中的作用[12-13]。

3 CYP誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生

細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450 enzymes，CYP）是單加氧酶的一個(gè)超級家族，被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物，多數(shù)負(fù)責(zé)異生素的解毒反應(yīng)。CYP是ER中電子傳輸鏈的一部分，其構(gòu)成一系列含血紅素的酶，在許多內(nèi)源性和外源性化合物的氧化代謝中發(fā)揮重要的作用[14]。異生物質(zhì)侵入時(shí)，其代謝過程中CYP對有毒化合物的反應(yīng)會是ROS的一個(gè)重要來源。遇到底物時(shí)，CYP與一分子氧相結(jié)合后連接到目標(biāo)化合物上形成氧復(fù)合物。氧復(fù)合物通過中間反應(yīng)被還原成過氧化合物，接受兩個(gè)質(zhì)子并產(chǎn)生水，其過程中超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷的代謝物會被CYP轉(zhuǎn)化為ROS。CYP通過與其氧化還原伴侶NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶（NADPH-cytochrome P450 reductase，NPR）以摩爾比為1∶1的形式相互作用來催化這些反應(yīng)[15]。在底物代謝過程中，電子從NADPH轉(zhuǎn)移到細(xì)胞色素P450還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR），然后由CPR轉(zhuǎn)移到CYP[16]。從NADPH到CYP的電子轉(zhuǎn)移的效率或程度低至0.5%～3.0%。NPR和真核CYP之間發(fā)生氧化還原循環(huán)時(shí)所引起的“電子泄漏”在ROS生成中起重要作用。

4 ERS條件下線粒體相關(guān)ROS的產(chǎn)生

ERS期間，ER和線粒體可以通過以下方法或因素相互作用。第一個(gè)因素是位置，即線粒體和ER之間的緊密靠近，引起兩個(gè)細(xì)胞器之間物理性的直接相互作用[17]；第二個(gè)因素是Ca2+的變化，影響線粒體膜電位三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）消耗和ROS形成[18]；第三個(gè)因素是特殊的誘導(dǎo)信號的表達(dá)，如Lon蛋白酶，其通過干擾細(xì)胞色素c氧化酶復(fù)合物裝配/降解來保護(hù)線粒體，并且類似地，誘導(dǎo)NIX（調(diào)節(jié)ER的Ca2+和線粒體膜電位的Bcl-2家族蛋白）表達(dá)并開放線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeablity transition pore，MPTP）[19]。因此，由ERS信號引發(fā)的ER腔中的氧化應(yīng)激的爆發(fā)作用于線粒體，以進(jìn)一步增強(qiáng)ROS的產(chǎn)生，以增加胞質(zhì)Ca2+或消耗ATP的方式，引發(fā)線粒體內(nèi)的氧化磷酸化，使ROS產(chǎn)生最大化。

4.1 GSH在ERS誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生中的作用

已有研究證明GSH在維持ER氧化還原酶的還原狀態(tài)中起核心作用[20]，其氧化形式及還原形式之間的比例是氧化還原環(huán)境的指示器[21]。在二硫鍵形成過程中，ERO-1被O2氧化，產(chǎn)生H2O2及副產(chǎn)物氧化型GSH。兩者都導(dǎo)致ER腔內(nèi)氧化還原狀態(tài)紊亂，進(jìn)而引起氧化應(yīng)激后的ERS[22-23]。GSH的消耗（通過ERS期間的二硫鍵還原）可使線粒體產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。線粒體相關(guān)ROS可能進(jìn)一步增強(qiáng)ERS反應(yīng)，從而增加線粒體ROS積聚，這是提示嚴(yán)重/持續(xù)性ERS相關(guān)性ROS和線粒體功能障礙的潛在信號機(jī)制。因此，哺乳動物和酵母細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激狀態(tài)并增加GSH的合成以降低ROS水平來保持氧化還原衡。

4.2 線粒體呼吸鏈系統(tǒng)在ERS誘導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生中的作用

線粒體在ERS介導(dǎo)ROS產(chǎn)生中發(fā)揮作用，干擾線粒體呼吸鏈可以顯著降低UPR誘導(dǎo)的ROS累積[25]。已有報(bào)道表明Ca2+誘導(dǎo)一氧化氮合酶生成一氧化氮（NO），抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅳ活性，進(jìn)一步增強(qiáng)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ中Qo位點(diǎn)的ROS生成[26]。此外，NO及高水平Ca2+可以抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，誘導(dǎo)MPTP的開放并阻斷復(fù)合物Ⅲ、釋放細(xì)胞色素c，從而增加ROS的產(chǎn)生。

5 ERS條件下Ca2+相關(guān)ROS的產(chǎn)生

Ca2+的釋放/遷移是與ERS條件高度相關(guān)的。ERS的早期階段，ROS水平升高導(dǎo)致的氧化應(yīng)激引起Ca2+通過膜連接通道從細(xì)胞外基質(zhì)流入細(xì)胞質(zhì)或通過ER/肌漿網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum，SR）定位的通道從ER/SR進(jìn)入胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度的增加促進(jìn)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞核和線粒體。線粒體Ca2+增加可促進(jìn)線粒體三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，刺激其代謝進(jìn)而增加ROS的產(chǎn)生。ROS可進(jìn)一步作為ER的反饋信號，增強(qiáng)Ca2+釋放通道的敏感性，進(jìn)而增加Ca2+從ER釋放的可能性[27]。此外，ER和線粒體之間物理性相互作用同樣會導(dǎo)致從ER釋放的Ca2+進(jìn)入線粒體，引起上述反應(yīng)。當(dāng)線粒體基質(zhì)內(nèi)的Ca2+返回到ER時(shí)正向反饋環(huán)會衰減。因此，ER/線粒體Ca2+循環(huán)對ERS介導(dǎo)ROS產(chǎn)生具有重要意義。

盡管在ER和細(xì)胞質(zhì)中均發(fā)生未折疊蛋白質(zhì)聚集，但在ERS條件下，ROS相關(guān)的小蛋白質(zhì)聚集體比較大的蛋白質(zhì)聚集體更有害，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合TATA結(jié)合蛋白和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白并損害泛素-蛋白酶途徑。相反，較大的蛋白質(zhì)聚集體和分子伴侶，如TRiC和HSP70，通過進(jìn)一步抑制聚集體形成而在細(xì)胞中起保護(hù)作用。由年齡、突變、特異性或環(huán)境因素等因素引起的ERS的失敗可能導(dǎo)致不同的疾病。原理上，氧化蛋白的聚集取決于氧化還原信號傳導(dǎo)介質(zhì)、抗氧化劑、促氧化劑和蛋白水解活性的平衡，最終提供構(gòu)象疾病的分子機(jī)制。

6 小結(jié)

在不同的亞細(xì)胞組分中，由于獨(dú)特的氧化環(huán)境，ER是細(xì)胞中最獨(dú)特和功能多樣的細(xì)胞器之一。在ER相關(guān)應(yīng)激條件下，氧化還原信號傳導(dǎo)介質(zhì)及線粒體在ROS生成中起關(guān)鍵作用。需要進(jìn)一步的研究來解釋ER和ROS關(guān)聯(lián)，以完全了解該途徑，闡明它們在生理和病理?xiàng)l件下相互作用的機(jī)制。這些信息將有助于更準(zhǔn)確和有效地治療或預(yù)防ERS相關(guān)疾病。

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