響應(yīng)面法優(yōu)化老山芹護綠工藝

王 炬,張秀玲,高 寧,于海鑫

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

老山芹(HeracleumoellendorffiiHance),又名東北牛防風(fēng)、山芹菜,主要分布在我國東北黑龍江省大興安嶺地區(qū),是東北地區(qū)一種著名的山野菜。老山芹富含膳食纖維、氨基酸、維生素和礦物質(zhì),特別是含有豐富的香豆素類和黃酮類化合物,能有效地預(yù)防和治療便秘、高血壓、高血脂和心血管類疾病,并對于心臟類疾病的術(shù)后康復(fù)、癌癥的治愈過程具有輔助效果[1-3]。老山芹的嫩葉和莖桿均可食用,常用其做餡料、炒菜、涼拌等。

新鮮老山芹采摘時間具有季節(jié)性,又極易老化、黃化,令老山芹不便加工與貯藏,進(jìn)而影響了老山芹本身的經(jīng)濟價值。由于對于老山芹這一山野菜的認(rèn)知度較小,開發(fā)利用率低,因此,現(xiàn)針對于老山芹加工技術(shù)的相關(guān)報道較少,但隨著山野菜的普及與推廣,針對于老山芹加工護綠技術(shù)的研究變得尤為重要。有研究表明,植物黃化、老化是葉綠素的降解導(dǎo)致的,而葉綠素降解主要由以下兩種途徑,一是由于光照、氧氣、pH、金屬離子導(dǎo)致的葉綠素內(nèi)卟啉環(huán)的中心Mg+被H+取代,形成脫鎂葉綠素,導(dǎo)致葉綠素結(jié)構(gòu)改變[4];二是酶促反應(yīng)、脂質(zhì)氧化導(dǎo)致的葉綠素降解,酶促降解途徑主要是由葉綠體中過氧化物酶-H2O2酶促降解系統(tǒng)和胞質(zhì)中的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)組成,這兩種降解系統(tǒng)與活性氧含量相關(guān)[5-7]。劉茜茜等[14]主要研究了不同護色劑與其交互作用對于果蔬的護色效果,以葉綠素含量或色差值為單一指標(biāo),來判定護色劑的護色效果,而忽略過氧化物酶活性在葉綠素降解中的重要性與相關(guān)性,從而無法從降解途徑解釋護色劑濃度的增加或減少是如何令果蔬的葉綠素含量發(fā)生改變的。

本實驗針對老山芹的生長特性和葉綠素特有的降解途徑,以葉綠素含量與過氧化物酶活性為指標(biāo),旨在為老山芹選擇最優(yōu)的天然護綠劑配方。以老山芹為原料,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對老山芹護綠劑進(jìn)行配方優(yōu)化,選用葉綠素銅鈉鹽、抗壞血酸、茶多酚濃度為影響因素,以老山芹葉綠素含量和過氧化物酶(POD)活性為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗,對老山芹護綠工藝進(jìn)行研究。以期延長老山芹的貯存期,增加老山芹的經(jīng)濟利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

老山芹 黑龍江省加格達(dá)奇農(nóng)林科學(xué)院;抗壞血酸、茶多酚、葉綠素銅鈉鹽(食品級) 哈爾濱市德美實驗儀器經(jīng)銷有限公司;食品耐高溫殺菌蒸煮袋 滄州華良包裝有限公司。

Tu-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;YP20002電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;G70D20CN1P-D2(S0)型微波爐 格蘭仕微波生活電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 微波輔助護綠劑護綠工藝流程

1.2.1.2 配制護綠劑 按照不同配方配制老山芹護綠溶液,利用檸檬酸調(diào)節(jié)溶液pH至6.50。

1.2.1.3 微波輔助護綠 將50 g老山芹原料浸泡在1.2.1.2所配置的200 mL護綠溶液中,置于功率為600 W的微波爐中處置2 min,靜置10 min。

1.2.1.4 冷卻 將靜置后的老山芹溶液迅速放入0 ℃的冰水中迅速冷卻至室溫,并用清水反復(fù)沖洗老山芹葉片表面,防止護綠劑溶液殘留,晾干。

1.2.1.5 真空包裝 將護綠后的50 g老山芹放入真空包裝袋中,注入20%氯化鈉水溶液200 mL,真空包裝。

1.2.1.6 高溫滅菌 將包裝完的老山芹放入高壓滅菌鍋內(nèi),根據(jù)孔瑾等[13]的研究結(jié)果及預(yù)實驗的實驗結(jié)果,設(shè)置滅菌溫度為95 ℃,時間為15 min。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 葉綠素銅鈉鹽濃度的確定 固定老山芹護綠劑溶液中抗壞血酸濃度為1.00 g/L,茶多酚濃度為1.50 g/L,選擇葉綠素銅鈉鹽濃度梯度為:0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 g/L,將老山芹浸泡在pH=6.50的護綠溶液中(物料比為1∶4),利用微波(600 W,2 min)輔助護綠劑進(jìn)行護綠處理,迅速冷卻至室溫,并用清水反復(fù)沖洗老山芹葉片表面,晾干,獲得經(jīng)護綠劑處理后的老山芹原料。研究老山芹護綠劑中葉綠素銅鈉鹽的濃度對老山芹原料中葉綠素和過氧化物酶活性的影響。

1.2.2.2 抗壞血酸濃度的確定 固定老山芹護綠劑溶液中葉綠素銅鈉鹽濃度為0.30 g/L,茶多酚濃度為1.50 g/L,選定護綠劑中抗壞血酸濃度分別為:0.50、0.75、1.00、1.25、1.75 g/L,其它步驟同1.2.2.1,研究老山芹護綠劑溶液中抗壞血酸濃度對老山芹原料中葉綠素和過氧化物酶活性的影響。

1.2.2.3 茶多酚濃度的確定 選定老山芹護綠劑溶液中茶多酚濃度分別為:1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 g/L,葉綠素銅鈉鹽濃度為0.30 g/L,抗壞血酸濃度為1.00 g/L,其它步驟同1.2.2.1,研究老山芹護綠劑溶液中茶多酚濃度對老山芹原料葉綠素和過氧化物酶活性的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素實驗基礎(chǔ)上,選取葉綠素銅鈉鹽A濃度(g/L)、抗壞血酸B濃度(g/L)和茶多酚C濃度(g/L)作為試驗因素,以葉綠素含量Y1(mg/g)和過氧化物酶活性Y2(U·g-1·min-1)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計,進(jìn)行 3因素3水平的響應(yīng)面實驗,具體見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.4 老山芹葉綠素含量及過氧化物酶活性測定方法

1.2.4.1 葉綠素含量的測定 在研缽中稱取 1.00 g老山芹樣品,加入適量石英砂、碳酸鈣,并加入5 mL 95%乙醇溶液充分研磨,直至組織發(fā)白,肉眼無可見的老山芹葉片。將研磨后的液體靜置7～8 min,過濾至50 mL 棕色容量瓶中,用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次,同樣過濾至棕色容量瓶中,定容至50 mL。利用紫外分光光度計分別在663、645 nm波長下測量其吸光值,根據(jù)下列公式計算葉綠素含量,實驗重復(fù)三次[14-15]。

葉綠素含量(mg/g)=[(20.29×A645+8.05×A663)×V]/(100×M)

式中,V:提取液總體積(mL);M:老山芹鮮重(g)。

1.2.4.2 過氧化物酶活性的測定 酶液的提取:在研缽中稱取1.00 g老山芹樣品,加入5 mL 0.20 mol/L pH6.5磷酸緩沖液冰浴研磨勻漿。將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管,并用少量磷酸緩沖液反復(fù)沖洗研缽,將液體一并轉(zhuǎn)入離心管中。在4 ℃,12000×g的條件下冷凍離心20 min,提取上清液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

過氧化物酶活性的測定:50 mL 0.2 mol/L pH=6.5的磷酸緩沖液+38 μL愈創(chuàng)木酚+19 μL 30%過氧化氫,混合均勻后得到酶反應(yīng)液,冷卻備用。在反應(yīng)池中加入1.5 mL的酶反應(yīng)液和0.5 mL酶液后,立即用紫外分光光度計,在470 nm處每隔1 min測量一次吸光度,共測量3次。以每分鐘內(nèi)ΔA470變化0.001定義為1個酶活性單位[16-17]。

過氧化物酶活性(U·g-1·min-1)

式中,ΔA470:3 min內(nèi)吸光度的變化;W:老山芹重量(g);t:反應(yīng)時間(min);VT:提取酶液總體積(mL);VS:測定時吸取酶液體積(mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用Excel 2007對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、整理后,運用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較和相關(guān)性分析,并運用Origin 8.5軟件作圖。同時采用Design-expert 8.0.6軟件中Box-behnken的中心組合設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 葉綠素銅鈉鹽濃度對老山芹葉綠素含量及過氧化物酶(POD)活性的影響 當(dāng)未添加護綠劑時,老山芹葉綠素含量為7.48 mg/g,POD活性為1340 U·g-1·min-1。添加一定濃度葉綠素銅鈉鹽后,結(jié)果如圖1所示。隨著葉綠素銅鈉鹽濃度的升高,老山芹葉綠素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,老山芹POD活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當(dāng)護綠劑中葉綠素銅鈉鹽濃度為0.30 g/L時,老山芹中葉綠素含量達(dá)到最大值11.35 mg/g,POD活性達(dá)到最低值515 U·g-1·min-1。當(dāng)葉綠素銅鈉鹽濃度由0.30 g/L逐漸升高,此時增加濃度葉綠素含量顯著降低(p<0.05),POD活性顯著升高(p<0.05)。特別當(dāng)濃度升高至0.50 g/L時,葉綠素含量降低至8.46 mg/g,POD活性升高至691 U·g-1·min-1,這是因為,當(dāng)護綠劑中的銅離子濃度過高時,老山芹體內(nèi)的內(nèi)源活性氧的清除功能降低,致使超氧自由基和H2O2基團大量累積,進(jìn)而導(dǎo)致POD活性增強[6],同時POD的活性增強促進(jìn)了POD-H2O2降解系統(tǒng)的進(jìn)行,進(jìn)而促進(jìn)葉綠素降解[7]。因此,葉綠素銅鈉鹽濃度選取0.30 g/L較為合適。

2.1.2 抗壞血酸濃度對老山芹葉綠素含量及過氧化物酶(POD)活性的影響 由圖2可知,抗壞血酸濃度對于老山芹葉綠素含量和POD活性有明顯的影響。當(dāng)老山芹護綠劑中抗壞血酸濃度為0.50～1.00 g/L時,老山芹葉綠素含量隨著抗壞血酸濃度的增加而升高,POD活性隨著抗壞血酸濃度的增加而降低,這是因為,抗壞血酸濃度的增加可以促進(jìn)老山芹葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中的抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)的進(jìn)行[5],而此系統(tǒng)主要是利用抗壞血酸過氧化物酶,來清除植物體中的H2O2,因此老山芹POD活性降低,葉綠素含量逐漸升高。當(dāng)抗壞血酸濃度為1.00 g/L時,老山芹葉綠素含量顯著高于其他濃度(p<0.05),并達(dá)到最高值15.94 mg/g,POD活性顯著低于其他濃度(p<0.05),并達(dá)到最低值854 U·g-1·min-1。隨著濃度繼續(xù)升高,老山芹葉綠素含量逐漸降低,POD活性逐漸升高。這是因為,當(dāng)抗壞血酸濃度過高時,老山芹植物體內(nèi)的pH發(fā)生改變,促進(jìn)葉綠素的卟啉環(huán)中的Mg+被H+取代形成脫鎂葉綠素,從而導(dǎo)致老山芹植物體內(nèi)金屬含量過多,促進(jìn)氧化反應(yīng)[13,26]。因此,抗壞血酸濃度選取為1.00 g/L較為合適。

圖2 抗壞血酸濃度對老山芹葉綠素含量與POD活性影響Fig.2 Effect of ascorbic acid concentration on chlorophyll content and peroxidase activity of Heracleu moellendorffii Hance

2.1.3 茶多酚濃度對老山芹葉綠素含量與過氧化物酶(POD)活性影響 由圖3所示,隨著茶多酚濃度的升高,老山芹葉綠素含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,老山芹POD呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當(dāng)茶多酚濃度為1.00～1.50 g/L時,老山芹葉綠素含量隨著茶多酚濃度的增加顯著升高(p<0.05),老山芹POD活性隨著茶多酚濃度的增加顯著減少(p<0.05)。這是因為,茶多酚可以清除自由基,從而使POD活性降低,防止類囊體細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化所導(dǎo)致的葉綠素釋放及降解[6]。當(dāng)茶多酚濃度為1.50 g/L時,老山芹葉綠素含量達(dá)到最高值11.59 mg/g,老山芹POD活性達(dá)到最低值854 U·g-1·min-1。濃度超過1.50 g/L時,葉綠素含量逐漸降低,POD活性逐漸升高。這是因為,茶多酚的大量累積,使老山芹本身自由基的清除功能降低,

圖3 茶多酚濃度對老山芹葉綠素含量與POD活性影響Fig.3 Effect of tea polyphenols concentration on chlorophyll content and peroxidase activity of Heracleu moellendorffii Hance

致使自由基基團大量累積,進(jìn)而導(dǎo)致POD活性增強,類囊體細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化加劇,從而促進(jìn)葉綠體降解[27]。因此,茶多酚濃度選取1.50 g/L較為合適。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取老山芹護綠劑中葉綠素銅鈉鹽濃度、抗壞血酸濃度、茶多酚濃度為試驗因素,老山芹葉綠素含量與過氧化物酶活性為響應(yīng)值,利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken實驗設(shè)計方案,對老山芹護綠配方進(jìn)行優(yōu)化,實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.1 老山芹葉綠素含量的回歸模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件,對表2中Y1葉綠素含量(mg/g)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程及方差分析,得到的分析結(jié)果見表3。

表3 Y1回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗Table 3 Regression equation coefficients and significant test of Y1

根據(jù)表3實驗結(jié)果,得到回歸模型(1)為:

Y1=16.81+0.94A-0.49B+1.37C+1.91AB-0.83AC-0.95BC-1.86A2-1.51B2-1.72C2

式(1)

通過表3可知,模型(1)中,A、B、C的一次項中A、B、C均對葉綠素含量的影響極顯著(p<0.01),在交互項中AB、AC、BC均對葉綠素含量的影響極顯著(p<0.01),二次項A2、B2、C2均表現(xiàn)為極顯著(p<0.01)。通過對比F值可知,對于葉綠素含量影響大小的順序為C>A>B,即茶多酚濃度>葉綠素銅鈉鹽濃度>抗壞血酸濃度。

2.2.2 老山芹葉綠素含量的響應(yīng)面分析 為了更加直觀形象的描述三個因素對于Y1響應(yīng)值的影響,利用Design-Expert 8.0.6軟件在固定一個因素不變的環(huán)境下,對另外兩個因素的交互作用做響應(yīng)面和等高線圖,分析其對于老山芹葉綠素的影響,其響應(yīng)面和等高線圖見圖4～圖6。

圖4 葉綠素銅鈉鹽濃度和抗壞血酸濃度對老山芹葉綠素含量交互作用的響應(yīng)面圖和等高線Fig.4 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and ascorbic acid concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

圖5 葉綠素銅鈉鹽濃度和茶多酚度對老山芹葉綠素含量交互影作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

圖6 抗壞血酸濃度和茶多酚度對老山芹葉綠素含量交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the interaction between ascorbic acid concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll in Heracleu moellendorffii Hance

由圖4可知,當(dāng)老山芹護綠劑中茶多酚濃度為1.50 g/L時,從響應(yīng)面圖曲線陡峭程度可以看出,A和B的交互作用對老山芹葉綠素含量有顯著的影響。由圖5可知,當(dāng)老山芹護綠劑中抗壞血酸濃度為1.00 g/L固定不變時,

A濃度小于0.30 g/L,C濃度小于1.45 g/L時,等高線較密集,表明在此范圍內(nèi)A和C濃度的交互作用對老山芹葉綠素含量的影響顯著。由圖6可知,當(dāng)老山芹護綠劑中葉綠素銅鈉鹽為0.30 g/L固定不變時,B濃度小于1.15 g/L,C濃度小于1.45 g/L時,等高線較密集,表明在此范圍內(nèi)B和C濃度的交互作用對老山芹葉綠素含量的影響顯著。以上結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.3 老山芹過氧化物酶活性(POD)回歸模型及方差分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中Y2POD(U·g-1·min-1)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸方程及方差分析,得到的分析結(jié)果見表4。

表4 Y2回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗Table 4 Regression equation coefficients and significant test of Y2

根據(jù)表4實驗結(jié)果,得到回歸模型(2)為:

Y2=464.45-126.46A-138.09B-110.15C+82.63AB+59.72AC+240.68BC+94.07A2+110.00B2+147.53C2

式(2)

通過表4可知,模型(2)中,A葉綠素銅鈉鹽濃度、B抗壞血酸濃度、C茶多酚濃度的一次項中A、B、C對老山芹POD活性的影響均顯示為差異性極顯著(p<0.01),交互項AB、BC、AC對老山芹POD活性的影響均表現(xiàn)為差異性極顯著(p<0.01),二次項A2、B2、C2對老山芹POD活性的影響均表現(xiàn)為差異性極顯著(p<0.01)。通過對比F值可知,對于老山芹POD活性影響大小的順序為B>A>C,即抗壞血酸濃度>葉綠素銅鈉鹽濃度>茶多酚濃度。

2.2.4 老山芹POD活性的響應(yīng)面分析 為了更加直觀地描述三個因素對于Y2響應(yīng)值的影響,利用Design-Expert軟件在固定一個因素不變的環(huán)境下,對另外兩個因素的交互作用做響應(yīng)面和等高線圖,分析其對于老山芹POD活性的影響,其響應(yīng)面和等高線圖見圖7～圖9。

圖7 葉綠素銅鈉鹽濃度和抗壞血酸濃度對老山芹POD活性交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and ascorbic acid concentration on the activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

圖8 葉綠素銅鈉鹽濃度和茶多酚度對老山芹POD活性交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour map of the interaction between chlorophyll sodium concentration and tea polyphenols concentration on the content of chlorophyll activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

圖9 抗壞血酸濃度和茶多酚度對老山芹POD活性交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour map of the interaction between ascorbic acid concentration and tea polyphenols concentration on the activity of peroxidase in Heracleummoellendorffii Hance

由圖7可知,當(dāng)老山芹護綠劑中茶多酚濃度固定為1.50 g/L,從響應(yīng)面圖曲線陡峭程度可以看出,A和B的交互作用對老山芹葉綠素含量有顯著影響,A濃度小于0.30 g/L,B濃度小于1.05 g/L 時,等高線較密集,表明在此范圍內(nèi)A和B濃度的交互作用對老山芹POD活性有顯著的影響[16-17]。由圖8可知,當(dāng)老山芹護綠劑中抗壞血酸濃度為1.00 g/L固定不變時,A濃度小于0.30 g/L,C濃度小于1.55 g/L時,等高線較密集,表明在此范圍內(nèi)A和C濃度的交互作用對老山芹POD活性有顯著影響。由圖9可知,當(dāng)老山芹護綠劑中葉綠素銅鈉鹽為0.30 g/L固定不變時,B濃度小于1.10 g/L,C濃度小于1.55 g/L 時,等高線較密集,表明在此范圍內(nèi)B和C濃度的交互作用對老山芹POD活性有顯著影響。以上分析結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致。

2.2.5 驗證實驗 通過響應(yīng)面試驗所獲得的老山芹葉綠素含量和POD活性的二次回歸數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,其結(jié)果顯示,老山芹護綠劑最佳工藝為:0.32 g/L葉綠素銅鈉鹽、0.95 g/L抗壞血酸、1.68 g/L茶多酚。在此工藝下,老山芹葉綠素含量預(yù)測值為17.02 mg/g,POD活性為443.32 U·g-1·min-1。為了驗證響應(yīng)面結(jié)果的準(zhǔn)確性,采用上述護綠工藝對老山芹進(jìn)行護綠實驗,并測量其葉綠素含量和POD活性,實驗重復(fù)三次,結(jié)果表明老山芹葉綠素含量為16.98 mg/g,POD活性為453.54 U·g-1·min-1,與理論值相差不大,實驗結(jié)果與模型切合度較好。滅菌后的老山芹產(chǎn)品在貯存三周后老山芹葉綠素含量僅下降2.60%,POD活性上升了3.10%。因此,此響應(yīng)面所獲得的老山芹護綠優(yōu)化加工工藝準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,以老山芹葉綠素含量和POD活性為響應(yīng)值,對老山芹護綠工藝中的老山芹護綠劑配方進(jìn)行了響應(yīng)面試驗,并建立了響應(yīng)值和各個因素之間的數(shù)學(xué)模型,根據(jù)此模型確定了老山芹護綠劑最佳優(yōu)化配方:0.32 g/L葉綠素銅鈉鹽、0.95 g/L抗壞血酸、1.68 g/L茶多酚,在此條件下,老山芹葉綠素含量為16.98 mg/g,POD活性為453.54 U·g-1·min-1,對老山芹有很好的護綠效果。滅菌后的老山芹產(chǎn)品在貯存三周后,老山芹葉綠素含量僅下降2.60%,POD活性上升了3.10%,對于老山芹的護綠具有一定的應(yīng)用價值。