血漿Spetin9甲基化對結(jié)直腸癌的診斷和治療監(jiān)測作用

余南榮 黃志良 吳成杰 魯偉群 楊國華 徐厚巍 劉海鷹

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸腫瘤外科（廣州 510095）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer）的發(fā)病率和死亡率近年在我國有持續(xù)升高的趨勢。早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療成為提高結(jié)直腸癌治愈率及延長患者生存時間的關(guān)鍵。但目前臨床中仍缺乏對結(jié)直腸癌早期診斷敏感且特異的腫瘤標志物，因此尋找更敏感和高特異性的監(jiān)測指標成為臨床亟待解決的問題。

Septin9基因甲基化是結(jié)直腸癌重要的生物學(xué)特征之一，其在結(jié)直腸癌患者外周血和腫瘤組織中均高表達，而在健康人群或其他結(jié)直腸疾病中呈低表達［1-2]。因此，Septin9基因甲基化有可能成為結(jié)直腸癌篩查診斷和治療監(jiān)測的一個候選標志物。但目前關(guān)于血漿甲基化Septin9在結(jié)直腸癌術(shù)后監(jiān)測、預(yù)測復(fù)發(fā)、評估生存等方面的報道較少，僅有小型病例研究結(jié)果表明Septin9甲基化可用于結(jié)直腸癌術(shù)后的隨訪監(jiān)測，并初步顯示其與結(jié)直腸癌患者術(shù)后生存呈負相關(guān)。此外，雖然血漿Septin9甲基化及血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）在結(jié)直腸癌診斷和監(jiān)測中都有重要作用，但每個指標單獨作為結(jié)直腸癌的診斷和預(yù)測指標都不能準確而完整地反映病情。因此，本研究擬通過采集結(jié)直腸癌患者手術(shù)前后及化療前后的外周血液，檢測血漿Septin9甲基化及血清CEA的表達并探索二者在結(jié)直腸癌診斷、預(yù)測復(fù)發(fā)方面的作用，從而為血漿Septin9甲基化成為結(jié)直腸癌診斷及監(jiān)測復(fù)發(fā)的標志物提供可靠的臨床依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象及病例入組標準于2015年12月至2016年4月間入組符合以下標準的結(jié)直腸癌患者：（1）既往未接受過任何抗腫瘤治療；（2）術(shù)后病理診斷證實為結(jié)直腸腺癌；（3）患者首次治療為手術(shù)切除或FOLFOX方案化療。同期收集30例我院自愿者健康人血液標本作為對照。病例剔除標準：（1）既往接受過抗腫瘤治療的患者；（2）術(shù)后病理診斷證實為非結(jié)直腸腺癌者；（3）患者首次治為非FOLFOX方案化療者。本研究已通過我院倫理委員會批準，所有研究對象已知情并簽署知情同意書。

1.2 血漿樣本的收集和保存對符合條件的結(jié)直腸腺癌病例依據(jù)治療方式進行分組：手術(shù)組血液標本的采集時間為：手術(shù)前、手術(shù)后4周；化療組血液采集時間為：化療前、2次化療后。每例血液樣本均詳細記錄對應(yīng)患者的一般資料、臨床信息、病理資料等。采樣時抽取10 mL/支靜脈全血2支，分別以EDTA抗凝和真空無抗凝處理，用于提取血漿和血清。樣本可立即用于Septin9基因甲基化和CEA測定，或保存于-20℃低溫冰箱，4周內(nèi)進行檢測。

1.3 血清CEA蛋白和血漿Septin9基因甲基化的檢測血清CEA表達水平由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科采用放射免疫熒光進行檢測。采用Septin9基因甲基化檢測試劑盒（PCR熒光探針法）檢測血漿Septin9甲基化水平。按照試劑盒說明書步驟對血漿中DNA進行提取、磁珠結(jié)合、洗滌和亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理，然后每個DNA樣本中按比例加入相應(yīng)體積的PCR反應(yīng)液和PCR聚合酶（PCR Master Mix），按照常規(guī)PCR擴增進行40個熱循環(huán)后讀取數(shù)據(jù)結(jié)果。每次實驗均設(shè)陰性和陽性對照，所有樣本均進行3次重復(fù)試驗。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有假設(shè)檢驗比較均為雙側(cè)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。計量資料兩組組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料組間比較采用行×列χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達情況在2015年12月至2016年4月間共收集符合條件的結(jié)直腸癌血漿樣本35例和健康人群血漿樣本30例。35例患者中，治療前血漿Septin9甲基化陽性表達26例，陰性表達9例，陽性率為74.3%（26/35）；血清CEA高于正常對照值（5.0 ng/mL）的有21例，正常范圍內(nèi)的有14例，陽性率為60.0%（21/35）。健康人群中血漿Septin9甲基化陽性0例，陰性30例，陽性率為0.0%（0/30）；血清CEA高于正常對照值（5.0 ng/mL）的有3例，正常范圍內(nèi)的有27例，陽性率為10.0%（3/30）。Septin9甲基化和血清CEA在結(jié)直腸癌患者和健康人群中的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。見表1。

表1 結(jié)直腸癌患者及健康人血漿Septin9甲基化和血清CEA的表達情況Tab.1 Comparison of plasma Septin9 methylation andserum CEA in colorectal cancerpatients and health controls

2.2 治療前后結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化的表達35例結(jié)直腸癌患者中有26例直接接受手術(shù)治療，另外9例接受FOLFOX方案化療。手術(shù)組中有20例術(shù)前為Septin9甲基化陽性，6例為陰性；經(jīng)手術(shù)完全切除腫瘤后由陽性變?yōu)殛幮?5例（轉(zhuǎn)陰率為75.0%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性的6例；術(shù)前血清CEA陽性（＞5.0 ng/mL）的有15例，陰性（＜5.0 ng/mL）有11例，術(shù)后由陽性變?yōu)殛幮?1例（轉(zhuǎn)陰率為73.3%），持續(xù)陽性4例，持續(xù)陰性的11例。

在化療組中，化療前血漿Septin9甲基化陽性有6例，陰性3例，經(jīng)化療后由陽性變?yōu)殛幮?例（轉(zhuǎn)陰率16.7%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性3例；化療前血清CEA陽性（＞5.0 ng/mL）的有6例，陰性（＜5.0 ng/mL）有3例，化療后由陽性變?yōu)殛幮?例（轉(zhuǎn)陰率為16.7%），持續(xù)陽性5例，持續(xù)陰性有3例。分析結(jié)果顯示，無論對于血漿Septin9甲基化或血清CEA水平，手術(shù)治療后指標轉(zhuǎn)陰率較化學(xué)治療更高（P=0.010，P=0.018）。見表2。

表2 手術(shù)治療和化學(xué)治療前后血漿Septin9甲基化血清CEA水平的變化Tab.2 Changes of plasma Septin9 methylation，serumCEA before and after operation and chemotherapy

2.3 血漿Septin9甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性通過記錄每例樣本的性別、年齡、腫瘤位置及TNM分期等臨床資料，與血漿Septin9甲基化檢測結(jié)果進行相關(guān)性分析（因35例結(jié)直腸癌患者中有2例無法確定病理分期，因此TNM分期與血漿Septin9甲基化相關(guān)性分析只納入33例患者）。結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床各病理參數(shù)的相關(guān)性如表3所示，Septin9甲基化水平與結(jié)直腸癌患者的年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期和是否存在遠處轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

2.4 血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌診斷的意義上述部分結(jié)果表明血漿Septin9甲基化與臨床結(jié)直腸癌診斷的相符率為74.3%，血清CEA對結(jié)直腸癌診斷陽性率為60.0%，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.203），提示兩者診斷效能相類似。為進一步分析兩種分子標志物對提高結(jié)直腸癌診斷的準確性，筆者分析了血漿Septin9甲基化聯(lián)合血清CEA水平對結(jié)直腸癌的診斷率，結(jié)果顯示兩者聯(lián)合診斷結(jié)直腸癌的陽性率為82.9%，較單獨檢測血清CEA水平的陽性率明顯升高（P=0.034）。見表4。

表3 35例結(jié)直腸癌患者血漿Septin9甲基化與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性Tab.3 Relationship between plasma Septin9 methylation and clinicopathological parametersin 35 colorectal cancer patients

表4 血漿Septin9甲基化和血清CEA水平檢測對結(jié)直腸癌診斷比較Tab.4 Comparison of the diagnostic value between plasma Septin9 methylation and serum CEA

3 討論

Septin基因廣泛存在于絕大多數(shù)真核生物中，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)14個Septin基因，分別被命名為Septin1～Septin14?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Septin家族與神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤、感染、不育癥等疾病發(fā)生有關(guān)。Septin基因家族相關(guān)的腫瘤疾病包括白血病及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、腎細胞癌等實體腫瘤。Septin9定位于染色體17q25.3，該染色體區(qū)段是散發(fā)性卵巢癌和乳腺癌的常見雜合性丟失部位。研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與基因的甲基化密切相關(guān)［3]，基因芯片檢測結(jié)果分析表明Septin9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達。

目前有研究表明血漿Septin9甲基化在結(jié)直腸癌診斷中具有一定的意義［4-12]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)直結(jié)腸癌患者患病的過程中體內(nèi)的部分基因發(fā)生甲基化，將甲基化的異?；蜃鳛榉肿訕擞浳飳τ诩膊〉暮Y查具有一定的可操作性［13-14]。GRüTZMANN等［15]進行了結(jié)直腸癌患者血漿甲基化Septin9檢測研究，其結(jié)果顯示血漿甲基化Septin9在結(jié)直腸癌患者中的陽性率為48%（120/252），明顯高于健康對照組的7%（7/102）?？蒂坏龋?6]研究表明，結(jié)直腸癌患者血漿中Septin9基因甲基化檢測的靈敏度為75.0%，特異度為98.1%，優(yōu)于糞便隱血試驗。有研究發(fā)現(xiàn)，Septin9基因甲基化檢測結(jié)直腸癌不受年齡和性別的影響，但其基因甲基化水平與種族有一定的相關(guān)性［17-18]。本研究通過分析結(jié)直腸癌患者治療前后血漿Septin9甲基化狀態(tài)與血清CEA蛋白水平，發(fā)現(xiàn)血漿Septin9甲基化對結(jié)直腸癌的診斷陽性率與血清CEA水平相似，兩者聯(lián)合檢測可顯著提高診斷陽性率；治療后血漿Septin9甲基化狀態(tài)也可出現(xiàn)相應(yīng)變化，提示其也可用于治療期間的病情監(jiān)測。

在本研究中，結(jié)直腸癌患者中Septin9的甲基化水平顯著高于健康人群，其陽性率達到74.3%，再加上血漿Septin9甲基化水平檢測具有無創(chuàng)、簡便、靈敏度較高的優(yōu)勢，故筆者認為其是輔助結(jié)直腸癌診斷較為理想的指標。在本研究中，筆者還發(fā)現(xiàn)手術(shù)組結(jié)直腸癌患者中，手術(shù)切除腫瘤后血漿Septin9甲基化由陽性變化為陰性的比例顯著高于化療組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.010），提示Septin9的甲基化水平與結(jié)直腸癌患者的帶瘤狀態(tài)顯著相關(guān)，并具有類似于血清CEA可監(jiān)測結(jié)直腸癌患者治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛能，但其預(yù)測作用及其特異性仍需進一步研究。

由于本研究的結(jié)果提示血漿Septin9甲基化與血清CEA均有輔助結(jié)直腸癌診斷的作用，但單獨檢測血漿Septin9甲基化或血清CEA仍容易漏診一部分結(jié)直腸癌患者；且在健康人群中，血清CEA也存在一定的假陽性率，目前關(guān)于血漿Septin9甲基化和血清CEA聯(lián)合檢測的報道較少，需進一步對該方向進行深入研究。為此，本研究分析了血漿Septin9甲基化與血清CEA水平聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌的診斷陽性率，其結(jié)果為82.9%，與CEA單獨檢測比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.034），提示血漿Septin9甲基化與血清CEA的聯(lián)合檢測可以提高結(jié)直腸癌檢測的陽性率。同時Septin9的甲基化水平檢測可提示結(jié)直腸癌患者的荷瘤狀態(tài)。因此，檢測Septin9的甲基化水平，特別是與CEA聯(lián)合進行檢測，具有重要的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，血漿Septin9甲基化水平的檢測具有可作為結(jié)直腸腺癌的篩查和診斷指標的潛能，其對結(jié)直腸癌的診斷效能與血清CEA相類似，陽性符合率高達74.3%，且本研究中Septin9甲基化水平診斷結(jié)直腸癌的敏感性稍優(yōu)于血清CEA水平的檢測。若將血漿Septin9甲基化水平檢測及血清CEA水平檢測二者聯(lián)合應(yīng)用，其敏感性優(yōu)于血清CEA單獨檢測，兩者聯(lián)用可以提高結(jié)直腸腺癌診斷的陽性率，具有一定的臨床應(yīng)用價值。