線粒體轉(zhuǎn)錄因子A與冠心病的相關(guān)性

嚴(yán)亞琪 李碩 董文超 劉超 王鵬飛 侯維娜 侯瑞田 丁振江 王瑞鵑

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科（河北承德 067000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）一直被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)的主要死亡原因，在過去的幾十年中，有效的診斷方法能減少其對全球公共衛(wèi)生的負(fù)擔(dān)［1]。但在中國這樣的發(fā)展中國家仍有上升的趨勢。冠心病的病理基礎(chǔ)多為冠狀動脈粥樣硬化。mtDNA的損傷可以導(dǎo)致線粒體功能障礙，促進(jìn)炎癥及細(xì)胞凋亡，這些皆可推動動脈粥樣硬化的進(jìn)程；因此mtDNA的損傷可能與動脈粥樣硬化有關(guān)［2-3]。外周血線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）通過包裹mtDNA形成類似組蛋白的核樣結(jié)構(gòu)［4]，維護(hù)其完整和穩(wěn)定，使其免受氧化應(yīng)激（ROS）損傷［5]；同時通過促進(jìn)mtDNA的復(fù)制來調(diào)節(jié)其拷貝數(shù)，這是TFAM保護(hù)線粒體功能的基礎(chǔ)［6]。KRISH等［7]證明了過表達(dá)的TFAM可防止糖尿病DRG神經(jīng)元中的mtDNA拷貝數(shù)的減少，并預(yù)防實(shí)驗(yàn)性的糖尿病神經(jīng)病變，從而保護(hù)DRG神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激的損傷。因此TFAM可作為研究線粒體生物合成調(diào)控機(jī)制的重要靶點(diǎn)之一。有研究表明冠心病患者中外周血mtDNA拷貝數(shù)較正常人明顯減少，這種變化可作為氧化應(yīng)激水平增加的指標(biāo)，同時可用來評估冠心病的嚴(yán)重程度［8]。在對線粒體的調(diào)控中，相較于mtDNA來說TFAM的變化更早期、更直接，目前，尚未見冠心病與TFAM的相關(guān)報道，為此，本研究對冠心病患者外周血的TFAM mRNA進(jìn)行了檢測來證明TFAM的表達(dá)是否與冠心病密切相關(guān)。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年3-9月在承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院擬診為冠心病無親屬關(guān)系，且無其他類型冠狀動脈病變、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)正常的患者，根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入92例患者，其中冠脈造影確診為CHD（至少1支主要血管狹窄程度≥50%）患者56例為CHD組（男36例，女20例），36例冠狀動脈造影陰性者為對照組（男19例，女17例）。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)所有受試者均排除縮窄性心包炎、心臟瓣膜病、心力衰竭、心源性休克、嚴(yán)重肝腎功能不全、發(fā)熱及感染、線粒體相關(guān)性疾病、近期重大手術(shù)外傷、各種惡性腫瘤、結(jié)締組織病等。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選患者在研究前均簽署知情同意書。

1.3 流行病學(xué)與臨床資料收集記錄研究對象的一般資料和既往病史，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、既往高血壓及糖尿病病史。測量入院時身高、體重、血壓（收縮壓SBP、舒張壓DBP），計算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。臨床指標(biāo)測定：測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、靜脈空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、尿酸（UA）、白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞計數(shù)（neutrophil）、淋巴細(xì)胞計數(shù)（lymphocyte）及紅細(xì)胞分布寬度（red cell distribution width，RDW），并計算中性粒細(xì)胞計數(shù)與淋巴細(xì)胞計數(shù)比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）。

1.4 實(shí)時定量PCR法檢測TFAM mRNA水平所有研究對象均采集肘靜脈血至少3 mL，以肝素鈉抗凝，樣品收集完成后，應(yīng)用Qiagen血液基因組RNA提取試劑盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit），嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作提取2組血液樣品中的RNA，應(yīng)用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（FastQuant RT Kit）對所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；并應(yīng)用Combasz 480實(shí)時PCR定量檢測儀擴(kuò)增TFAM和管家基因（GAPDH），獲得TFAM的特異性擴(kuò)增曲線和溶解曲線。引物序列為TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反應(yīng)體系（25μL）：ddH2O 9.0 μL，2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，PCR正向引物（55μmol/L）0.75μL，PCR反向引物（55μmol/L）0.75μL，待測cDNA模板（200 ng/μL）2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，62℃退火20 s和72℃延伸20 s，共45個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用目的基因Ct值與管家基因Ct值的比值作為每個標(biāo)本TFAMmRNA的表達(dá)水平，其中Ct值為標(biāo)本擴(kuò)增到規(guī)定閾值時PCR循環(huán)數(shù)，Ct比值越大表示表達(dá)量越低。

1.5 冠狀動脈血管病變支數(shù)及狹窄程度評價所有患者均以Judkins法行冠狀動脈造影術(shù)，由兩位心內(nèi)科介入組醫(yī)生進(jìn)行診斷，若診斷結(jié)果出現(xiàn)不統(tǒng)一的情況下，另請一位介入醫(yī)生進(jìn)行診斷，全程采用盲法分析。記錄冠狀動脈有無狹窄等。將冠狀動脈管腔狹窄≥50%納入CHD組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用統(tǒng)計軟件SPSS19.0處理數(shù)據(jù)。計量資料正態(tài)性檢驗(yàn)選Kolmogorov-Smirnova檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間均數(shù)比較選擇t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用頻數(shù)（百分比）表示，組間率或構(gòu)成比的比較用χ2檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析以明確指標(biāo)之間的相關(guān)性，TFAM mRNA與冠心病的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。冠心病的危險因素分析采用多因素Logistic回歸分析，在單因素分析的基礎(chǔ)上，選取有意義的（包括年齡、NLR、吸煙及TFAM mRNA的Ct比值）納入多因素Logistic回歸方程。上述均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

士人贊賞的態(tài)度固然激發(fā)了女性詩人更多的創(chuàng)作熱情，對于士人反對的聲音，女性詩人的心態(tài)與回應(yīng)也不盡相同。部分女詩人自覺約束自己的行為，毀棄詩作，放棄寫作，以合乎“規(guī)范”；另有一部分女詩人依然堅持寫作，她們或私下進(jìn)行，或公然反抗。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料、血液檢測指標(biāo)及外周血TFAM mRNA含量比較結(jié)果顯示兩組在性別、年齡、SBP、DBP、BMI、吸煙率、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在冠心病組患者中，TFAM mRNA的Ct比值（1.39±0.06）高于對照組（1.35±0.08），即TFAM mRNA表達(dá)量低于對照組；NLR值（3.37±2.31）高于對照組（2.46±1.32）；淋巴細(xì)胞計數(shù)（24.77±8.40）低于對照組（29.04±7.47）；差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 兩組患者基線資料的比較Tab.1 Comparison of the baseline datas between CHD group and control group

表2 兩組患者血液檢測指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

表2 兩組患者血液檢測指標(biāo)的比較Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

注：WBC，白細(xì)胞計數(shù)；Neu，中性粒細(xì)胞計數(shù)；Lym，淋巴細(xì)胞計數(shù)；RDW，紅細(xì)胞分布寬度；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C，低密度脂蛋白膽固醇；FBG，靜脈空腹血糖；BUN，尿素氮；Cre，肌酐；UA，尿酸；NRL，中性粒細(xì)胞計數(shù)與淋巴細(xì)胞計數(shù)比值；TFAM mRNA的Ct比值，目的基因Ct值與管家基因Ct值的比值

指標(biāo)WBC（109/L）Neu（109/L）Lym（109/L）RDW（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）FBG（mmol/L）Cre（mmol/L）BUN（umol/L）UA（mmol/L）TFAMmRNA的Ct比值NLR對照組（n=36）6.61±1.50 62.83±9.28 29.04±7.47 42.26±2.78 4.25±1.09 1.95±1.23 1.16±0.27 2.28±0.76 6.29±2.37 64.33±14.24 5.63±1.55 324.07±93.18 1.35±0.08 2.46±1.32 CHD組（n=56）7.13±2.11 66.64±9.78 24.77±8.40 42.35±2.45 4.10±1.40 1.98±1.43 1.10±0.32 2.13±0.91 6.69±2.41 67.53±13.72 5.49±1.44 320.53±79.48 1.39±0.06 3.37±2.31 t值-1.302-1.880 2.483-0.163 0.539-0.105 0.957 0.835-0.782-1.069 0.451 0.195-2.664-2.139 P值0.196 0.064 0.015 0.871 0.591 0.917 0.341 0.406 0.436 0.289 0.653 0.846 0.009 0.035

2.2 相關(guān)性分析Pearson相關(guān)分析：TFAMmRNA的Ct比值與中性粒細(xì)胞計數(shù)、NLR呈正相關(guān)，分別為r=0.316、P=0.002，r=0.238、P=0.023；與淋巴細(xì)胞計數(shù)呈負(fù)相關(guān)，r=-0.323、P=0.002；則TFAM mRNA與中性粒細(xì)胞計數(shù)、NLR呈負(fù)相關(guān)，與淋巴細(xì)胞計數(shù)呈正相關(guān)。Spearman相關(guān)分析：TFAM mRNA的Ct比值與冠心病呈正相關(guān)，r=0.227、P=0.029，則TFAM mRNA與冠心病呈負(fù)相關(guān)。

2.3 多因素Logistic回歸結(jié)果年齡（OR=1.058，95%CI：1.003 ～ 1.115，P=0.038）及 TFAM mRNA的 Ct比值（OR=2.358，95%CI：1.166 ～ 4.765，P=0.017）可能是冠心病的危險因素，而TFAM mRNA可能是冠心病的保護(hù)因素。見表3。

3 討論

TFAM是由核基因編碼的一種小分子多肽，能激活及調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)錄及復(fù)制，并在氧化應(yīng)激中起著重要作用。研究表明，在缺血再灌注心肌細(xì)胞中，TFAM水平明顯下降，并且在已死亡心肌中TFAM表達(dá)消耗殆盡［9-10]。同時近期研究顯示，可以通過檢測外周血TFAM mRNA水平來預(yù)測關(guān)節(jié)疾病，且外周血TFAMmRNA的表達(dá)量與軟骨細(xì)胞TFAM的表達(dá)量呈正相關(guān)（r=0.662，P＜ 0.01）［11]。因此本研究通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)測定了56例CHD患者和36例對照組患者外周血TFAM mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)CHD組與對照組相比，外周血TFAM mRNA表達(dá)量低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 冠心病的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of CHD

在冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙發(fā)揮著重要的作用［12]。近年來許多實(shí)驗(yàn)證明內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷和功能障礙可由氧化應(yīng)激誘導(dǎo)［13-14]。氧化應(yīng)激通過ROS的產(chǎn)生及脂質(zhì)過氧化對動脈粥樣硬化產(chǎn)生影響，從而引起血管的炎癥反應(yīng)。

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)ROS的主要靶點(diǎn)，ROS產(chǎn)生的增加誘導(dǎo)了mtDNA的顯著損害［8]。研究表明線粒體DNA在線粒體能量代謝中起重要作用，因此線粒體DNA的改變（線粒體DNA的突變或者拷貝數(shù)的變化）都可能會導(dǎo)致氧化磷酸化障礙，增加ROS的產(chǎn)生或使線粒體生物合成減少。同時，上述改變反過來又會加速線粒體DNA的異常［15]。這種惡性循環(huán)最終會誘導(dǎo)線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡［16]，這在動脈粥樣硬化早期階段具有重要意義［14]。既往進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)了冠心病患者靜脈血中mtDNA的變化趨勢，而這種變化可能與TFAM存在一定的相關(guān)性。

TFAM作為線粒體生物合成的主要因子，具有誘導(dǎo)特定區(qū)域線粒體DNA結(jié)構(gòu)改變的功能。目前研究顯示，TFAM可調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、重組及空間結(jié)構(gòu)及線粒體ATP的產(chǎn)生［5]。另外多項(xiàng)研究表明，在氧化應(yīng)激作用下，TFAM作為保護(hù)因子可以對抗ROS對細(xì)胞線粒體的損傷［9，17-18]，本研究Spearman相關(guān)性分析顯示TFAM mRNA與冠心病呈負(fù)相關(guān)；多因素Logistic回歸分析示TFAM mRNA為冠心病的保護(hù)性因素。因此，TFAM表達(dá)量的改變對mtDNA含量及線粒體功能具有重要的作用，這與既往所做的研究結(jié)論是一致的［19]，并且本研究顯示與冠心病組相比，對照組中TFAM mRNA的表達(dá)量更高，由此，本研究推測外周血TFAM mRNA表達(dá)量與冠心病密切相關(guān)。

本研究是回顧性觀察性研究，缺少干預(yù)。且選取病例數(shù)偏少，使得檢驗(yàn)效能下降。本研究的患者均選自承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科住院患者，未采用隨機(jī)對照，存在選擇偏倚。另外目前外周血TFAM mRNA沒有確定的正常范圍。

綜上所述，冠心病與TFAM密切相關(guān)，但其與冠脈病變嚴(yán)重程度及冠心病的預(yù)后是否相關(guān)還需日后進(jìn)行更深一步的研究。