Lnc-ATB通過吸附miR-433促進(jìn)宮頸癌侵襲及轉(zhuǎn)移

李柏森 文敏 易紅梅 姜鶴群

1電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，四川省癌癥防治中心，四川省腫瘤醫(yī)院放療中心（成都 610041）；成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 2胸心外科，3腫瘤科（成都 610500）

宮頸癌為女性發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，其病原體主要為高風(fēng)險(xiǎn)性的人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HPV）［1-2]。隨著早期篩查的普及和治療手段的豐富，宮頸癌患者的診斷和預(yù)后均得到了顯著的提升。然而，宮頸癌發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，明確其發(fā)病機(jī)制，鑒定新的潛在治療靶點(diǎn)具有重要意義。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ）活化長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA）LncRNA-ATB（Lnc-ATB）是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)可被轉(zhuǎn)化生長因子活化的長鏈非編碼RNA［3]，研究發(fā)現(xiàn)Lnc-ATB在腎癌［4]、乳腺癌［5]和結(jié)腸癌［6]等腫瘤中異常高表達(dá)，并可通過吸附miR-200家族成員而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，尚缺少關(guān)注Lnc-ATB在宮頸癌中細(xì)胞中的表達(dá)和作用的相關(guān)機(jī)制研究。本課題擬檢測Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)，并明確Lnc-ATB在宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及潛在機(jī)制。本研究結(jié)果首次證實(shí)了Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過吸附結(jié)合miR-433促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，為宮頸癌提供了新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料Trizol購買于美國Sigma公司；RNA反轉(zhuǎn)錄及QPCR試劑盒購買于日本TAKARA公司；Transwell小室購買于美國Millipore公司；細(xì)胞侵襲鋪板用基質(zhì)膠購買于美國BD公司；螢光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購買于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄細(xì)胞培養(yǎng)過夜至匯合度80%，加入Trizol裂解。離心5 min，上清加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。離心15 min，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 mL，離心5 min。所得沉淀加入20μL去離子水，即為所需RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄采用10μL體系，RNA定量后，取1μL RNA，加入5x PrimeScript RT master 2μL，7 μL去離子水。輕柔混勻后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃儲存。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)配置PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)采用25μL體系，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5μL，正義鏈引物1μL，反義鏈引物1μL，實(shí)時(shí)定量產(chǎn)物2μL，去離子水8.5μL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 30 s；擴(kuò)增95℃ 15 s，60℃30 s，共30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后樣品保存于4℃。

1.2.4 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用的小室為預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室，其余步驟同細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力檢測試驗(yàn)步驟如下，將無菌Tranwell小室置于24孔板中，24孔板加入700μL的含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，Transwell小室中加入200μL總數(shù)為1×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將24孔板置于細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)36 h。而后，棄去Transwell小室中的液體，取出小室，濕棉簽輕拭去未穿過膜的細(xì)胞。甲醇固定10 s，結(jié)晶紫染色30 s，PBS洗滌，完整切除小室膜，封片。顯微鏡200倍視野下統(tǒng)計(jì)隨機(jī)十個(gè)視野的細(xì)胞術(shù)，拍照，繪制統(tǒng)計(jì)圖。

1.2.5 細(xì)胞劃痕接種宮頸癌細(xì)胞接種室6孔板中，孵育至宮頸癌細(xì)胞融合率達(dá)到100%后，用1 mL槍頭均勻地在6孔板細(xì)胞接種孔中間部位劃痕，劃痕后用PBS清洗細(xì)胞3次，而后加入不含血清的培養(yǎng)基。倒置顯微鏡拍照，將細(xì)胞間間隙定義為0 h。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，再次拍照，此時(shí)細(xì)胞間間隙定義為24 h。兩次拍照間單側(cè)的間隙距離之差，即為細(xì)胞的遷移距離。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)細(xì)胞培養(yǎng)過夜至匯合度達(dá)70%后，共轉(zhuǎn)染miR-433 mimics/miR-433 NC和pmiR-GLO-WT/Mut Lnc-ATB質(zhì)粒。裂解細(xì)胞后，取10μL樣品加入100μL熒光素酶檢測試劑，上機(jī)測定熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，3組數(shù)據(jù)間的比較依次采用方差分析和兩兩比較的t檢驗(yàn)；兩組數(shù)據(jù)間的比較直接應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞及正常宮頸內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)差異QPCR結(jié)果顯示：Lnc-ATB在正常宮頸內(nèi)皮細(xì)胞（normal cervical endothelial cells，NCEC）中的相對表達(dá)量為1.000±0.050，Lnc-ATB在宮頸癌HeLa細(xì)胞中的相對表達(dá)量為4.132±0.147，在宮頸癌SiHa細(xì)胞中的相對表達(dá)量為3.717±0.064。方差分析結(jié)果顯示，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.436，P＜0.05）。進(jìn)一步應(yīng)用t檢驗(yàn)分析Lnc-ATB在HeLa與NCEC，及SiHa與NCEC之間的表達(dá)水平差異，結(jié)果顯示，LncATB在HeLa與NCEC及SiHa與NCEC之間的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A：HeLavs.NCEC：t=5.921，P=0.027；SiHavs.NCEC：t=4.817，P=0.033），HeLa及SiHa細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)水平顯著高于NCEC細(xì)胞。

為了研究Lnc-ATB對宮頸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響，本研究合成了特異性沉默Lnc-ATB表達(dá)的慢病毒shRNA，QRT-PCR結(jié)果顯示：感染Lnc-ATB NC的宮頸癌HeLa細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對表達(dá)量為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的宮頸癌HeLa細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對表達(dá)量為0.315±0.017，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間Lnc-ATB表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B：t=4.889，P=0.031）。感染Lnc-ATB NC的宮頸癌SiHa細(xì)胞中LncRNA-ATB的相對表達(dá)量為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的SiHa細(xì)胞中LncRNAATB的相對表達(dá)量為0.373±0.023，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間Lnc-ATB表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1B：t=4.172，P=0.037）。Lnc-ATBshRNA可特異性地沉默HeLa及SiHa細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)。

2.2 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力Tranwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染Lnc-ATBNC的宮頸癌HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對轉(zhuǎn)移細(xì)胞比為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的宮頸癌HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對轉(zhuǎn)移細(xì)胞比分別為0.327±0.013和0.414±0.015。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間轉(zhuǎn)移細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。沉默Lnc-ATB可抑制宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

圖1 LncRNA-ATB在正常宮頸內(nèi)皮細(xì)胞及宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of LncRNA-ATBin NCECand cervical cancer

圖2 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移（×200）Fig.2 Lnc-ATBpromote cell migration of cervical cancer（×200）

2.3 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移能力細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Lnc-ATBNC的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對遷移距離為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染Lnc-ATB shRNA的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對遷移距離為0.518±0.062和0.477±0.059。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間細(xì)胞遷移距離差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3：HeLa：t=3.451，P=0.041；SiHa：t=3.551，P=0.037）。沉默Lnc-ATB表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞遷移距離短于Lnc-ATB NC組。

圖3 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移距離（×100）Fig.3 Lnc-ATBpromote migrated distance of cervical cancer（×100）

2.4 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲能力Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染Lnc-ATB NC的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對侵襲細(xì)胞比率為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染Lnc-ATB shRNA的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞的相對侵襲細(xì)胞比率為0.416±0.033和0.515±0.032。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組間轉(zhuǎn)移細(xì)胞比率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4：HeLa：t=3.225，P=0.039；SiHa：t=2.882，P=0.042）。沉默Lnc-ATB可抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲能力。

圖4 Lnc-ATB促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲（×200）Fig.4 Lnc-ATB promote cell invasion of cervical cancer（× 200）

2.5 Lnc-ATB在HEK-293T細(xì)胞中可吸附miR-433如圖5A，生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示Lnc-ATB存在miR-433結(jié)合位點(diǎn)，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-433 NC和pmirGLO-ATB WT組相對熒光強(qiáng)度為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染miR-433 mimics和pmirGLO-ATBWT組相對熒光強(qiáng)度為0.312±0.041，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5B，t=4.184，P=0.022），miR-433可特異性地與Lnc-ATB結(jié)合并降低其熒光強(qiáng)敵。

2.6 Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)miR-433的表達(dá)QPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-433 NC的HeLa及SiHa細(xì)胞中Lnc-ATB的相對表達(dá)水平為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染miR-433 mimics的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞中Lnc-ATB的相對表達(dá)水平分別為0.953±0.048和0.097 4±0.061，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組間Lnc-ATB表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6A：HeLa：t=0.515，P=0.368；SiHa：t=0.412，P=0.419）。轉(zhuǎn)染Lnc-ATB NC組HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞中miR-433的相對表達(dá)水平為1.000±0.050，轉(zhuǎn)染Lnc-ATB shRNA組的HeLa細(xì)胞及SiHa細(xì)胞中miR-433的相對表達(dá)水平為3.318±0.105和2.938±0.074。t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組間miR-433差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6B：HeLa：t=4.981，P=0.018；SiHa：t=3.217，P=0.021）。沉默宮頸癌細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)可使miR-433表達(dá)水平上調(diào)。

圖5 Lnc-ATB在宮頸癌中吸附結(jié)合miR-433Fig.5 Lnc-ATBsponge and bind with miR-433 in cervical cancer

圖6 Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中下調(diào)miR-433的表達(dá)Fig.6 Lnc-ATBdown-regulated miR-433 expression in cervical cancer

3 討論

既往研究顯示，多種腫瘤和疾病中均存在Lnc-ATB的異常表達(dá)，在肝細(xì)胞癌［7]、甲狀腺乳頭狀癌［8]、腎細(xì)胞癌［4]、骨肉瘤［9]等多種腫瘤中Lnc-ATB表達(dá)異常上調(diào)，是潛在的致癌分子。在宮頸癌細(xì)胞和組織中，研究顯示Lnc-ATB表達(dá)亦異常上調(diào)，并與腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和FIGO分期密切相關(guān)。更為重要的是，Lnc-ATB與宮頸癌患者術(shù)后不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為判斷宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)［10]。與既往研究結(jié)果相符，本研究結(jié)果顯示Lnc-ATB在宮頸癌HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中的表達(dá)水平高于正常宮頸內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步提示Lnc-ATB在宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著致癌分子的作用。

Lnc-ATB是可特異性被TGF-β通路活化的長鏈非編碼RNA。其可通過吸附miR-200家族成員而間接上調(diào)ZEB1、ZEB2等miR-200家族的靶分子，并可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的重要分子E-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［2，10]。本研究結(jié)果顯示，沉默宮頸癌細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞遷移距離縮短，提示沉默Lnc-ATB的表達(dá)，可抑制宮頸癌的侵襲能力。

本研究利用生物信息學(xué)手段尋找與Lnc-ATB存在潛在結(jié)合位點(diǎn)的miRNA。結(jié)果顯示miR-433存在Lnc-ATB結(jié)合位點(diǎn)，并可與其結(jié)合。進(jìn)一步研究表明Lnc-ATB可在宮頸癌細(xì)胞中特異性地下調(diào)miR-433的表達(dá)。MiR-433是經(jīng)典的腫瘤抑制性miRNA，在口腔鱗狀上皮癌中，miR-433可通過靶向抑制FAK的表達(dá)而抑制其細(xì)胞增殖［12]。在宮頸癌中，miR-433表達(dá)異常下調(diào)，并與宮頸癌瘤體大小、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況呈負(fù)相關(guān)，其潛在機(jī)制為miR-433通過直接抑制異粘蛋白的表達(dá)而調(diào)控AKT和β-catenin信號通路，從而抑制宮頸癌細(xì)胞的發(fā)生及進(jìn)展［13]。結(jié)合既往研究結(jié)果和本研結(jié)果，提示Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中發(fā)揮競爭性內(nèi)源性RNA作用，吸附并降低miR-433的表達(dá)，使其抑癌作用受到抑制，從而促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，需進(jìn)一步的機(jī)制研究明確Lnc-ATB與miR-433之間的調(diào)控關(guān)系。

綜上所述，本研究通過QCR技術(shù)檢測了宮頸癌和正常宮頸細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常宮頸細(xì)胞。沉默宮頸癌細(xì)胞中Lnc-ATB的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力降低。機(jī)制研究結(jié)果顯示，Lnc-ATB在宮頸癌細(xì)胞中可吸附并下調(diào)miR-433的表達(dá)。本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，提供了潛在的宮頸癌靶向治療靶點(diǎn)。