RGD肽修飾量子點(diǎn)介導(dǎo)光動(dòng)力治療促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力

蔡筱蕾 沈玉潔 曹佳 徐雷鳴

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（上海 200092）

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤，其五年生存率不足5%，缺少早期診斷及有效的干預(yù)手段是導(dǎo)致其高致死率的主要原因之一［1-2]。由于進(jìn)展期胰腺癌的治療面臨常著傳統(tǒng)放化療不敏感、毒副作用大，分子靶向藥物耐藥，基因治療不完善等問(wèn)題［3]，人類迫切需要尋找新的治療方法補(bǔ)充或替代傳統(tǒng)的治療方法。光動(dòng)力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種針對(duì)局部腫瘤的消融術(shù)，其在微創(chuàng)性、低毒性、對(duì)腫瘤的高親和性和幾乎可忽略的耐藥性等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)［4]，是一種具有一定前景的胰腺癌治療手段。前期研究工作中，課題組成功合成一種新型光敏劑量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）-RGD（arginine-glycine-aspartic peptide）生物熒光探針。已證實(shí)通過(guò)瘤內(nèi)注射量子點(diǎn)-RGD于裸鼠皮下胰腺癌移植瘤內(nèi)進(jìn)行PDT，可增加光敏劑在胰腺癌組織的濃度、延長(zhǎng)光敏劑在瘤體內(nèi)的滯留時(shí)間、顯著提高PDT療效，并減少光敏劑在其他器官的累積［5]。本研究目的在于探討量子點(diǎn)-RGD介導(dǎo)的光動(dòng)力治療對(duì)胰腺癌侵襲的影響，為量子點(diǎn)-RGD在胰腺癌光動(dòng)力治療中的作用及機(jī)制做進(jìn)一步研究。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)材料人胰腺癌細(xì)胞SW1990購(gòu)于上海中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。量子點(diǎn)（Qdot?705 ITKTMCarboxyl Quantum Dots）購(gòu)自 Thermo Fisher Scientific公司。RGD肽購(gòu)自吉爾（上海）生化有限公司。EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。兔抗人單克隆抗體MMP2、兔抗人單克隆抗體MMP9均購(gòu)于美國(guó)abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR試劑盒購(gòu)于日本Takara公司。裸鼠普通飼料：上海新華醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)提供。4%多聚甲醛溶液：購(gòu)自廣州賽國(guó)生物科技有限公司。

1.2 量子點(diǎn)-RGD的制備取50μL的羧基水溶性量子點(diǎn)（Qdot?705）于試管中，加入20 mmol/L，pH 7.4的硼酸鹽緩沖液稀釋至終濃度1μmol/L。加入偶聯(lián)劑EDC和RGD肽至上述溶液中室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)液通過(guò)脫鹽柱洗脫一次，收集有熒光的溶液，用超濾管（截留分子量50 kDa）超濾3次除去未反應(yīng)的RGD肽和其它雜質(zhì)，終產(chǎn)物濃縮并保存于50 mmol/L，pH 8.4硼酸緩沖液中。

1.3 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)將Transwell小室包被Matrigel基質(zhì)膠80μL（1∶4稀釋），37℃孵育6 h。在上室及下室均加入500μL無(wú)血清培養(yǎng)基4℃冰箱過(guò)夜。根據(jù)分組將處理后的細(xì)胞，消化離心，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次后，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/mL。每孔上室加入100μL，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48～60 h后，取出小室，棄上清，用棉簽擦去小室內(nèi)壁殘留細(xì)胞及Matrigel基質(zhì)膠。甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，晾干后將小室置于顯微鏡下拍照并隨機(jī)計(jì)算8個(gè)視野穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4 Western blot法將處理后細(xì)胞培養(yǎng)至密度為90%時(shí)，消化離心，加入含有PMSF的蛋白裂解液，冰上放置45 min，4℃離心，取上清。采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。取80μg總蛋白，配制10%聚丙烯酰胺凝膠，80 V電泳120 min。后300 mA轉(zhuǎn)膜100 min。使用含5%脫脂奶粉的TBST室溫?fù)u床封閉2 h，TBST清洗3次，加入MMP2抗體（1∶500），MMP9抗體（1∶200）以及β-Actin抗體（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗（1∶1 000）室溫?fù)u床孵育1 h，TBST清洗3次。ECL超敏發(fā)光液發(fā)光。

1.5 Real-time PCR法按照Takara公司相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；虮磉_(dá)通過(guò)2-△△Ct法分析方法進(jìn)行計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物：MMP2上游：ATGAAGCACAGCAGGTCTCA；MMP2下游：TGAAGCCAAGCGGTCTAAGT；MMP9上游：CGGACCAAGGATACAGTTTGTT；MMP9下游：GTTCAGGGCGAGGACCATAG；β-Actin上游：TCCTTCCTGGGCATGGAGT；β-actin下游：CAGGAGGAGCAATGATCTTGAT。

1.6 裸鼠皮下成瘤及PDTSW1990細(xì)胞在37℃、5%CO2飽和濕度無(wú)菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。將5×105腫瘤細(xì)胞0.2 mL接種于5周齡BALB/c-nu/nu裸鼠背側(cè)皮下，建立腫瘤模型，密切觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。待3周后腫瘤長(zhǎng)至0.5～0.8 cm3，將裸鼠分為4組，每組3只。第一組瘤內(nèi)注射5 pmol量子點(diǎn)-RGD，應(yīng)用注射針頭插入瘤體內(nèi)，將光導(dǎo)纖維插入針頭，給以PDT激光治療機(jī)的激光照射；第二組瘤內(nèi)注射5 pmol量子點(diǎn)-RGD，不予以PDT照射；第三組未瘤內(nèi)注射任何試劑，應(yīng)用注射針頭插入瘤體內(nèi)，將光導(dǎo)纖維插入針頭，給以PDT激光治療機(jī)的激光照射；第四組空白對(duì)照。兩周后重復(fù)上述過(guò)程，觀察腫瘤生長(zhǎng)及侵襲情況。

1.7 免疫組化觀察期結(jié)束后，用頸椎脫臼法處死裸鼠，無(wú)菌條件下取出腫瘤組織，腫瘤組織以10%甲醛固定并制成病理切片。將移植瘤切片進(jìn)行免疫組化染色，將石蠟切片脫蠟至水，后EDTA抗原修復(fù)緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。放入3%過(guò)氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清室溫封閉30 min，加一抗，加二抗，使用DAB顯色法顯色。Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，后脫水封片。顯微鏡下觀察殘存細(xì)胞MMP2、MMP9的表達(dá)情況，圖像采集分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。兩組實(shí)驗(yàn)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 量子點(diǎn)-RGD-PDT存活SW1990腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)通過(guò)體外細(xì)胞侵襲-Transwell法模擬體內(nèi)侵襲過(guò)程，測(cè)定腫瘤細(xì)胞侵襲人工基底膜的能力，可以間接反映腫瘤細(xì)胞體內(nèi)侵襲能力。結(jié)果顯示，各組穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量如下：空白對(duì)照組20.875±3.551、量子點(diǎn)-RGD組23.375±2.233、單光照組24.250± 2.681、量子點(diǎn)-RGDPDT組62.625±7.088。比較各組細(xì)胞數(shù)量結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，量子點(diǎn)-RGD-PDT組存活SW1990腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到膜下表面的明顯增多，約為對(duì)照組的3倍（圖1），其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖1 量子點(diǎn)-RGD介導(dǎo)PDT增強(qiáng)SW1990胰腺癌細(xì)胞體外侵襲能力Fig.1 QDs-RGDinduced PDTto enhance the ability of invasion on SW1990 cells.

2.2 量子點(diǎn)-RGD-PDT存活SW1990腫瘤細(xì)胞的MMP2及MMP9表達(dá)增強(qiáng)MMP2、MMP9能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分Ⅳ型膠原，與腫瘤的浸潤(rùn)關(guān)系最為密切。本研究采用Realtime PCR檢測(cè)細(xì)胞MMP2及MMP9的mRNA表達(dá)（圖2），用Western blot方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的MMP2及MMP9蛋白的表達(dá)（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活的SW1990腫瘤細(xì)胞的MMP2及MMP9的mRNA表達(dá)均增高（P＜0.05），約為對(duì)照組的2.09倍及1.7倍（圖2）。細(xì)胞的MMP2及MMP9的表達(dá)蛋白也相應(yīng)均增高（P＜0.05），約為對(duì)照組的1.9倍及3.76倍（圖3 B）。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)量子點(diǎn)-RGD-PDT后MMP2和MMP9表達(dá)的影響Fig.2 Real-time PCR detected the effects of QDs-RGD mediated PDTon MMP2 and MMP9 expression

圖3 Western blot檢測(cè)量子點(diǎn)-RGD-PDT后MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響Fig.3 Western blot detected the effects of QDs-RGDmediated PDT on MMP-2 and MMP-9 expression.

2.3 量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)侵襲能力增強(qiáng)將SW1990細(xì)胞接種于5周齡裸鼠背側(cè)皮下，建立腫瘤模型。3周后，長(zhǎng)至0.5～0.8 cm3，將裸鼠分為4組，給予相應(yīng)處理。2周后，重復(fù)處理一次。觀察期結(jié)束后，頸椎脫臼法處死裸鼠，無(wú)菌條件下取出腫瘤組織，制成病理并切片進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)存活SW1990細(xì)胞MMP2及MMP9表達(dá)情況。結(jié)果顯示，量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活的SW1990腫瘤細(xì)胞的MMP2及MMP9的表達(dá)均增高（圖4）。

3 討論

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)量子點(diǎn)-RGD-PDT后移植瘤組織MMP2及MMP9蛋白表達(dá)的情況（×40）Fig.4 Immunohistochemical detected the effects of QDs-RGD mediated PDT on MMP2 and MMP9 expression（× 40）

胰腺癌是一種兇險(xiǎn)的惡性腫瘤，五年生存率不到5%，在歐美國(guó)家惡性腫瘤病死率排第4位，每年約有10萬(wàn)人死于胰腺癌［6]。目前主要的治療手段是根治性手術(shù)切除［7]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期研究，胰腺癌在早期診斷和放化療單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用方面雖有一定進(jìn)展，但生存率仍然不理想［8]。光動(dòng)力治療被認(rèn)為是治療各種癌癥和血管增生性疾病非常有前景的新方法。其原理是利用光敏劑選擇性聚積、滯留于腫瘤組織，并在特定波長(zhǎng)光照下，通過(guò)光化學(xué)或光生物學(xué)反應(yīng)對(duì)瘤組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，從而達(dá)到局部治癌的目的［9]。胰腺為腹膜后器官且為乏血供腫瘤，因此使用傳統(tǒng)光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力治療效果不佳［10]。因此，筆者期望能開(kāi)發(fā)出更合適的光敏劑，以用來(lái)提高PDT的治療效率。

量子點(diǎn)是一種特殊納米材料，顆粒直徑一般＜10 nm，由Ⅱ～Ⅳ族元素或ⅢⅤ族元素組成［11]。量子點(diǎn)受激后可發(fā)射熒光以及介導(dǎo)PDT殺傷腫瘤細(xì)胞，具有激發(fā)光譜寬和發(fā)射光譜窄等優(yōu)點(diǎn)。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞上整合素 αvβ3（integrin αvβ 3）受體具有很好的靶向性［12]。筆者將RGD偶聯(lián)量子點(diǎn)制成生物探針，使量子點(diǎn)更穩(wěn)定、生物相容性更好，并且增加光敏劑在胰腺腫瘤內(nèi)的聚集濃度及滯留時(shí)間，從而使增強(qiáng)光動(dòng)力作用效果。根據(jù)前期研究，量子點(diǎn)-RGD已經(jīng)被證明在體外實(shí)驗(yàn)中可作為新型光敏劑應(yīng)用于對(duì)胰腺癌的光動(dòng)力治療研究中［13]，并且體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)證明量子點(diǎn)-RGDPDT可使胰腺癌細(xì)胞凋亡［5，14]。

相關(guān)研究證實(shí)PDT可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、局部炎癥反應(yīng)以及血管損傷等，這些反應(yīng)可導(dǎo)致血管生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等表達(dá)增加，這些因子的激活與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)［15-16]。目前大多數(shù)關(guān)于新型光敏劑的研究?jī)H關(guān)注是否導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞凋亡，而忽視殘存胰腺癌細(xì)胞的情況。而大多侵襲研究集中于光動(dòng)力治療后短期內(nèi)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，而忽視其遠(yuǎn)期效應(yīng)，缺乏長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)的研究。這也可以部分解釋為什么有的研究結(jié)果顯示光動(dòng)力治療后腫瘤細(xì)胞的侵襲潛能增加，而有的研究卻發(fā)現(xiàn)其侵襲潛能降低。腫瘤細(xì)胞的侵襲包括一系列復(fù)雜的過(guò)程，MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族，大部分能降解基膜成分和ECM，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是所有MMPs中分布最廣的，位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜上，是MMPs激活過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一［17]。FERRARIO等［18]研究顯示，光動(dòng)力治療乳腺腫瘤24 h后，MMP9表達(dá)明顯增加，MMP1，MMP3和MMP8也出現(xiàn)表達(dá)增加的情況。采用光動(dòng)力治療與MMPs抑制劑TIMP-1聯(lián)合應(yīng)用后，能改善乳腺腫瘤的治療效果。因此，就新型光敏劑量子點(diǎn)-RGD而言，不僅需要研究其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生存的影響，也需要研究對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲潛能的影響。

量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活的SW1990胰腺癌細(xì)胞侵襲性變化有待于進(jìn)一步探索。鑒于此，筆者采用SW1990胰腺癌細(xì)胞系設(shè)計(jì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及構(gòu)建皮下移植瘤裸鼠模型，觀察并研究量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活的SW1990胰腺癌細(xì)胞侵襲潛能的變化。在體外實(shí)驗(yàn)中，利用包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的侵襲情況。本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，量子點(diǎn)-RGD-PDT組侵襲力上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而單純光照組和量子點(diǎn)-RGD組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。此外，本研究提取PDT治療后的SW1990細(xì)胞的總蛋白及總RNA，應(yīng)用Western blot及Real-time PCR技術(shù)了解侵襲相關(guān)蛋白MMP2及MMP9的表達(dá)情況。筆者發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)-RGD-PDT后殘存SW1990胰腺癌細(xì)胞MMP2及MMP9的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本研究建立裸鼠皮下移植瘤模型，瘤內(nèi)注射量子點(diǎn)-RGD后行PDT，觀察腫瘤生長(zhǎng)及侵襲情況，移植瘤進(jìn)行免疫組化染色，觀察細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2及MMP9的表達(dá)。結(jié)果顯示，量子點(diǎn)-RGD-PDT組移植瘤殘存細(xì)胞MMP2及MMP9表達(dá)較其他組明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示量子點(diǎn)-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)能力增強(qiáng)可能與誘導(dǎo)MMPs表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

不同胰腺癌細(xì)胞系其生物學(xué)特性并非完全相同，不同的光敏劑，不同的光照時(shí)間及光照能量可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)，對(duì)于其他胰腺癌細(xì)胞系而言，是否會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)、量子點(diǎn)-RGD-PDT使胰腺癌細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)的光照時(shí)間、光照能量仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，量子點(diǎn)-RGD介導(dǎo)光動(dòng)力治療后SW1990胰腺癌細(xì)胞侵襲潛能增強(qiáng)，誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞MMP2和MMP9蛋白表達(dá)增加是侵襲潛能增強(qiáng)的原因之一。