超聲波在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用進(jìn)展

陳俊林 王 嫣

1(重慶醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院 重慶 400016)

2(省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地——重慶市超聲醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市微無創(chuàng)醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心 重慶 400016)

1 引 言

干細(xì)胞治療即通過工程化手段將具有分化潛能的胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞大量擴(kuò)增，使其可適應(yīng)機(jī)體生化和生理?xiàng)l件進(jìn)行遷移、增殖和分化，進(jìn)而代替病變組織的一種治療方式。干細(xì)胞治療是目前再生醫(yī)學(xué)中重要且有效的治療手段，其研究包括機(jī)體內(nèi)的遷移、增殖、分化、解剖分布和作用機(jī)制等。研究顯示，與胚胎干細(xì)胞相比，成體干細(xì)胞(在已經(jīng)分化的組織中存在的具有自我更新和多能性的一類細(xì)胞)具有來源廣泛、免疫排斥反應(yīng)弱、致瘤風(fēng)險低、倫理學(xué)爭議較少等優(yōu)勢[1]，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域具有更好的應(yīng)用前景。然而，無論是胚胎干細(xì)胞還是成體干細(xì)胞，單獨(dú)的干細(xì)胞治療均存在組織內(nèi)細(xì)胞活性降低、流失、擴(kuò)散等問題，較難達(dá)到預(yù)期的治療效果[2]。隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，聯(lián)合其他工程技術(shù)如超聲波[3]、極低頻電磁場[4]、激光[5]等以增強(qiáng)干細(xì)胞治療效果的研究逐漸受到關(guān)注。超聲波作為一種機(jī)械波，振動頻率在 20 kHz 以上。研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度(＜3 W/cm2)超聲波能夠刺激體外培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及促進(jìn)腿部靜脈性潰瘍的肉芽組織的形成[6]，該發(fā)現(xiàn)使低強(qiáng)度超聲波在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究熱潮興起并愈來愈深入。隨著研究的不斷進(jìn)展，低強(qiáng)度超聲波具有無創(chuàng)、安全、簡便、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)已廣為人知，在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的應(yīng)用前景也越來越被看好，已逐漸發(fā)展成為促進(jìn)干細(xì)胞治療療效的有效技術(shù)手段。以下將針對低強(qiáng)度超聲波在干細(xì)胞治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展做相關(guān)介紹。

2 低強(qiáng)度超聲波的干細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)

超聲波作用于干細(xì)胞的物理機(jī)制為：超聲波在介質(zhì)中傳播時，介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)在其平衡位置附近作往復(fù)運(yùn)動，使介質(zhì)內(nèi)部發(fā)生有節(jié)律的疏密變化，這種疏密變化形成了壓力變化，能對細(xì)胞產(chǎn)生微細(xì)按摩作用。這種對細(xì)胞的微細(xì)按摩作用可以改變細(xì)胞的體積和膜的通透性，促進(jìn)代謝物質(zhì)的交換，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能[7]。干細(xì)胞的功能發(fā)生改變則會產(chǎn)生相對應(yīng)的組織生物學(xué)效應(yīng)，具體表現(xiàn)在對干細(xì)胞增殖、遷移、分化及活性的影響。

2.1 對干細(xì)胞增殖的影響

干細(xì)胞作為適于組織、器官替代治療需要的良好種子細(xì)胞，其研究仍面臨著如何有效和大規(guī)模的體外擴(kuò)增培養(yǎng)以獲取足夠數(shù)量的細(xì)胞來源、維持干細(xì)胞的增殖能力和傳代次數(shù)等問題。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一種能分化為成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞系的多能干細(xì)胞，來源廣泛并易于體外培養(yǎng)，被認(rèn)為具有良好的臨床應(yīng)用潛力[8]。于海生等[9]證實(shí)了低強(qiáng)度超聲波輻照一定時間后能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)增殖，接種密度為 2×104/mL 細(xì)胞增殖活性曲線更加穩(wěn)定。不同的輻照強(qiáng)度和輻照時間促進(jìn)增殖的效應(yīng)不同。其中，當(dāng)強(qiáng)度為 0.2 W/cm2、輻照 10 min 時，促進(jìn)增殖效果最佳[10]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞源性神經(jīng)嵴干細(xì)胞(Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells，iPSCs-NCSCs)能分化為神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞等，患者自身來源的 iPSCs-NCSCs 免疫排斥反應(yīng)低，道德倫理爭議少，可以作為神經(jīng)細(xì)胞再生的重要細(xì)胞來源[11]。Lv 等[12]采用頻率為 1 MHz，強(qiáng)度分別為500 mW/cm2、1 500 mW/cm2的低強(qiáng)度超聲波輻照 EdU＋細(xì)胞 10 min/d。4 天后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)強(qiáng)度為500 mW/cm2時，能顯著促進(jìn) EdU＋細(xì)胞數(shù)量增多；但當(dāng)強(qiáng)度提升為 1 500 mW/cm2時，EdU＋細(xì)胞數(shù)目反而減少。這說明低強(qiáng)度超聲波能促進(jìn)iPSCs-NCSCs 增殖，但增殖效應(yīng)因超聲劑量不同而異。隨著研究的不斷深入，研究者對低強(qiáng)度超聲波促進(jìn)干細(xì)胞增殖機(jī)制的認(rèn)識也不斷加深。Bmi-1 基因是維持成體干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等祖細(xì)胞增殖所必需的一種重要基因，其表達(dá)量對干細(xì)胞自我增殖效率方面的影響較大。胡帥[13]檢測了低強(qiáng)度超聲波輻照前后 Bmi-1 基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)體系中經(jīng)低強(qiáng)度超聲波輻照后的 Bmi-1 基因表達(dá)均高于空白對照組，同時也明顯高于原代細(xì)胞。證實(shí)了低強(qiáng)度超聲波能有效提高 Bmi-1 基因的表達(dá)，即從分子水平上調(diào)控細(xì)胞的增殖。Ling 等[14]研究表明，低強(qiáng)度超聲波輻照后能促進(jìn)人羊膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞從G0/G1 期進(jìn)入 S 期和 G2/M 期，激活 ERK1/2 和Akt 通路并促使其磷酸化，同時上調(diào) cyclin D1、cyclin E1、cyclin A2、cyclin B1 表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。綜上，低強(qiáng)度超聲波促進(jìn)干細(xì)胞增殖的效果毋庸置疑，但干細(xì)胞在超聲的作用下會不會無限制地增殖直至成瘤，至今未見報道。干細(xì)胞的致瘤性也是限制其臨床應(yīng)用的重要風(fēng)險因素。未來，研究者可針對超聲波對成體干細(xì)胞的致瘤風(fēng)險展開深入研究及評估。

2.2 對干細(xì)胞分化的影響

在 MSCs、iPSCs-NCSCs 等干細(xì)胞修復(fù)組織的研究中，不僅要促進(jìn)其擴(kuò)增，而且更重要的是要誘導(dǎo)其向特定組織分化。干細(xì)胞分化的本質(zhì)是細(xì)胞在基因表達(dá)上的時空差異。這種基因表達(dá)的差異除了由細(xì)胞內(nèi)在的發(fā)育程序決定外，還受細(xì)胞外環(huán)境的影響和調(diào)控，且有時這種外部控制條件或環(huán)境對形成特定細(xì)胞有著決定性作用[15]。在軟骨分化研究中發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度超聲波：可提高細(xì)胞生長因子 TGF-β 介導(dǎo)的人MSCs 的蛋白多糖沉積從而促進(jìn)人 MSCs 向軟骨分化的效率[16]；能夠刺激海藻酸鈉凝膠培養(yǎng)的兔MSCs 向軟骨分化[17]；可聯(lián)合纖維蛋白透明質(zhì)酸(fibrin-Hyaluronic Acid，fibrin-HA)使 MSCs 分化成高質(zhì)量的軟骨組織[18]。研究表明機(jī)械信號的缺乏會抑制 MSCs 向成骨細(xì)胞分化[19]，因此Uddin 和 Qin[20]將 MSCs 在 1D 回旋器中模擬微重力條件進(jìn)行培養(yǎng)，采用強(qiáng)度為 30 mW/cm2的低強(qiáng)度超聲波每天輻照 20 min 發(fā)現(xiàn)，與對照組對比，超聲組中 ALP、OSX、RANKL、RUNX2的表達(dá)提高，而 OPG 的表達(dá)減少，恢復(fù)了約22% 的 ALP 陽性細(xì)胞數(shù)。證明低強(qiáng)度超聲波刺激的效果等同于正常重力條件下的效應(yīng)，能促進(jìn) MSCs 成骨分化，從而修正體內(nèi)成骨分化不正常的現(xiàn)象。Kusuyama 等[21]進(jìn)一步研究認(rèn)為低強(qiáng)度超聲波在促進(jìn) MSCs 成骨分化的同時抑制脂肪細(xì)胞的分化。何瑞欣[22]則發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲波可以加速 BMSCs 向成骨和血管內(nèi)皮方向分化，使其更快生成骨組織和血管組織。在雙向同時誘導(dǎo)條件下，低強(qiáng)度超聲波對 BMSCs 分化率的提高作用最明顯。神經(jīng)細(xì)胞分化研究中，以神經(jīng)干/祖細(xì)胞(Neural Stem/Progenitor Cells，NSPCs)以及 iPSCs-NCSCs 為研究對象，研究者期望將體外擴(kuò)增的干細(xì)胞(如 iPSCs-NCSCs)移植到損傷部位以替代和補(bǔ)充死亡的神經(jīng)元及施旺細(xì)胞。Lee 等[23]發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲波能促進(jìn) NSPCs 向神經(jīng)元細(xì)胞分化，誘導(dǎo)神經(jīng)軸突生長并調(diào)節(jié)小分子神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮的生成。Lv 等[12]研究結(jié)果顯示，經(jīng)強(qiáng)度為 500 mW/cm2的低強(qiáng)度超聲波輻照后，iPSCs-NCSCs 中神經(jīng)元標(biāo)志物(NFM、Tuj1)的 mRNA 和蛋白表達(dá)量在第 4 天均上升；施旺細(xì)胞標(biāo)志物(S100β、GFAP)的 mRNA 和蛋白表達(dá)量在第 4、7 天均上調(diào)。表明低強(qiáng)度超聲波可促進(jìn) iPSCs-NCSCs 向神經(jīng)元和施旺細(xì)胞分化?？梢姡蛷?qiáng)度超聲波在合適的條件下可作為誘導(dǎo)細(xì)胞分化的外部控制條件協(xié)同細(xì)胞分化相關(guān)因子產(chǎn)生效應(yīng)，提高干細(xì)胞分化效率。但在超聲波的影響下，干細(xì)胞是否就只向指定方向分化，沒有分化的那部分干細(xì)胞是否會出現(xiàn)異常反應(yīng)？超聲波的劑量、輻照持續(xù)時間以及分化誘導(dǎo)劑的使用以哪種比例設(shè)計(jì)對促進(jìn)干細(xì)胞的分化效果最佳？以上問題還有待更深入的研究。

2.3 對干細(xì)胞遷移的影響

干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)遷移歸巢到病變部位的能力是干細(xì)胞治療的關(guān)鍵步驟之一。超聲波可以影響干細(xì)胞遷移，如在超聲波作用下血腦屏障的通透性一過性增加，有利于移植干細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮治療作用[24]。范國峰等[25]采用頻率 1 MHz、強(qiáng)度 1 W/cm2，進(jìn)行脈沖超聲輻照 2 min 以及加入微泡干預(yù) BMSCs，并通過 Transwell 小室培養(yǎng)法檢測其遷移能力。結(jié)果顯示，空白對照組、單純微泡組 BMSCs 的遷移能力較低，超聲聯(lián)合微泡組和單純超聲組細(xì)胞的遷移能力與空白對照組、單純微泡組間具有顯著差異，提示超聲及超聲聯(lián)合微泡作用能明顯增強(qiáng) BMSCs 的遷移能力。趨化因子、生長因子及黏附分子是 MSCs 歸巢過程中重要的相關(guān)因子。其中，趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1/CXCR4 軸是促進(jìn) MSCs 向損傷組織歸巢最重要的生物軸[26]；超聲聯(lián)合微泡協(xié)同脂質(zhì)體能夠安全、有效地提高 CXCR4 在 BMSCs 中的表達(dá)[27]。Jang 等[28]將低強(qiáng)度超聲波與兩種已知的趨化因子(fMLF、HMGB1 蛋白)對細(xì)胞遷移能力進(jìn)行對比。Transwell 試驗(yàn)和單層劃痕試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，低強(qiáng)度超聲波能夠顯著提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移能力，其機(jī)制可能與黏著斑激酶的活性相關(guān)。目前也有動物實(shí)驗(yàn)顯示，超聲聯(lián)合微泡能夠提高移植干細(xì)胞在心肌缺血區(qū)歸巢率[29-32]，但其作用機(jī)制仍然不明確。由于干細(xì)胞遷移受營養(yǎng)、局部微環(huán)境等多種因素調(diào)控，膜內(nèi)信號網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，低強(qiáng)度超聲波促進(jìn)干細(xì)胞體內(nèi)遷移和歸巢的確切機(jī)制仍不清楚，因此需要更多的深入研究提供理論依據(jù)。

超聲靶向微泡破壞技術(shù)(Ultrasound-Targeted Microbubble Destruction，UTMD)是近年來新興的靶向傳輸技術(shù)，目前已成功應(yīng)用于干細(xì)胞歸巢、藥物傳輸及基因轉(zhuǎn)染方面的研究。UTMD 以體內(nèi)或體外的單純微泡作為藥物和基因傳送的載體微泡為基礎(chǔ)，通過使用合適條件的超聲進(jìn)行輻照，基于超聲波的空化效應(yīng)，微泡被活化破滅釋放能量造成細(xì)胞或內(nèi)皮屏障可逆性損傷，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的通透性以達(dá)到靶向傳輸目的[33,34]，具體作用原理如圖 1 所示。局部炎癥反應(yīng)以及組織微循環(huán)的改善也被認(rèn)為是 UTMD 促進(jìn)干細(xì)胞移植的原因，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究[35]。

圖1 超聲靶向微泡破壞技術(shù)作用原理Fig. 1 The schematic diagram of ultrasound-targeted microbubble destruction

2.4 對干細(xì)胞活性的影響

超聲波的強(qiáng)度對細(xì)胞活性的影響非常大，如超聲波以一定強(qiáng)度在生物體內(nèi)傳播時可引起生物體結(jié)構(gòu)或功能的變化。其中，高強(qiáng)度超聲波對機(jī)體組織器官起破壞或損傷的作用，而低強(qiáng)度、小劑量則起調(diào)節(jié)刺激的作用[36,37]。雖然眾多研究已經(jīng)證實(shí)參數(shù)合適的超聲波能促進(jìn)干細(xì)胞增殖和分化，但超聲對干細(xì)胞活力的影響研究則較少。NSPCs 體外培養(yǎng)需充足的環(huán)境條件，Lee 等[23]認(rèn)為應(yīng)用強(qiáng)度從 0.1～0.5 W/cm2的低強(qiáng)度超聲波輻照能維持 NSPCs 細(xì)胞活力，且低強(qiáng)度超聲波聯(lián)合神經(jīng)生長因子能顯著提高NSPCs 存活率。Lim 等[38]指出使用占空比為20% 與 50% 的低強(qiáng)度超聲波輻照對人牙槽骨來源 MSCs 的細(xì)胞活力無明顯差異，但顯著高于對照組的 MSCs，提示低強(qiáng)度超聲波能增強(qiáng)人牙槽骨來源 MSCs 的細(xì)胞活力。Lee 等[39]觀察到 3D 海藻酸鈉凝膠與 TGF-β 培養(yǎng)的人 MSCs向軟骨誘導(dǎo)分化 2 周后，會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡所介導(dǎo)的細(xì)胞活力下降。在同樣的條件下，采用頻率為 1 MHz、強(qiáng)度為 0.2 W/cm2的連續(xù)超聲波輻照后，能顯著增強(qiáng)人 MSCs 的活力，并影響其 p53、bax、bcl-2、PCNA 等凋亡與存活的相關(guān)基因的表達(dá)。Peng 等[40]使用低強(qiáng)度超聲波刺激造血干/祖細(xì)胞(Hematopoietic Stem/Progenitor Cell，HSPC)發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度超聲波能增強(qiáng) HSPC增殖，維持低溫保存的 HSPC 體外活性且不影響 CD34 與 CD14 陽性細(xì)胞比例。因此，我們認(rèn)為低強(qiáng)度超聲波刺激有望能提高 HSPC 臨床移植和細(xì)胞治療的效率。隨著生物材料和新型藥物研究的不斷深入，聯(lián)合應(yīng)用超聲波治療可能會成為解決干細(xì)胞活力不足的最具潛力手段。

以往研究認(rèn)為中、小劑量(0.1～2 W/cm2)的超聲波是正性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用，故把惡性腫瘤列為臨床低強(qiáng)度超聲波治療禁忌癥[7]。隨著腫瘤干細(xì)胞學(xué)說[41]的提出，低強(qiáng)度超聲波對腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)獲得深入研究。金成兵[42]發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度超聲波可以抑制 Wnt/β-catenin 通路中關(guān)鍵因子 β-catenin 的產(chǎn)生，干擾該信號傳導(dǎo)途徑激活，阻止其激活相關(guān)靶基因，從而抑制肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖、更新、分化。此外，低強(qiáng)度超聲波可能會通過下調(diào) MDR1 基因及其相關(guān)產(chǎn)物來改善具有干細(xì)胞樣特點(diǎn)的 CD133＋肝癌細(xì)胞，有效逆轉(zhuǎn)肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的多重耐藥性。UTMD 研究的不斷深入，可對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行靶向性治療，有利于阻斷腫瘤發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。Shi 等[43]通過制作新型的載表柔比星聯(lián)合 ABCG2 抗體微泡，利用 UTMD抑制多發(fā)性骨髓瘤干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，并促進(jìn)其凋亡。此外，Liu 等[44]研究表明UTMD 介導(dǎo)的 CD133-shRNA 轉(zhuǎn)染后能顯著下調(diào) CD133＋肝癌干細(xì)胞 CD133 的表達(dá)，并抑制其增殖、侵襲及成瘤能力。鑒于腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性，超聲波治療對腫瘤細(xì)胞與腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)不盡相同，其是否能通過對腫瘤干細(xì)胞的抑制作用而對腫瘤治療起到輔助效果有待更深入的研究。

3 低強(qiáng)度超聲波聯(lián)合干細(xì)胞治療的研究進(jìn)展

目前，干細(xì)胞研究已經(jīng)進(jìn)入由基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究向臨床治療轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵階段。超聲聯(lián)合干細(xì)胞治療的在體研究如雨后春筍般涌現(xiàn)。

3.1 低強(qiáng)度超聲波聯(lián)合干細(xì)胞治療肌肉骨骼疾病

美國食品與藥品監(jiān)督委員會(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)分別于 1994 年、2000 年批準(zhǔn)了低強(qiáng)度超聲波用于新鮮骨折和骨不連的臨床治療。通過聯(lián)合干細(xì)胞，有望增加低強(qiáng)度超聲波對骨科疾病的療效。低強(qiáng)度超聲波可通過增強(qiáng) MSCs 內(nèi) SDF-1、CXCR4、BMP-2 的表達(dá)促進(jìn) MSCs 在損傷部位的募集能力以及成骨分化，從而促使骨折愈合[45,46]。He 等[47]手術(shù)制作股骨缺陷 SD 大鼠模型，然后使用海藻酸鈉凝膠培養(yǎng)的 MSCs 填充骨缺損部位并以強(qiáng)度為 0.2 W/cm2的低強(qiáng)度超聲波進(jìn)行輻照，超聲治療有效地促進(jìn) MSCs 從靜止期進(jìn)入成長/分裂期，增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)骨缺損愈合。Cui 等[48]把兔MSCs 接種于聚乙醇酸(Polyglycolic Acid，PGA)無紡網(wǎng)后置于軟骨分化培養(yǎng)基體外培養(yǎng) 1 周后，PGA/MSCs 被植入裸鼠背部皮下。之后超聲組采用頻率 0.8 MHz、強(qiáng)度為 0.2 W/cm2的超聲輻照，1 周后與 4 周后總膠原和糖胺聚糖含量均顯著高于對照組，且力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果顯示抗壓強(qiáng)度也顯著增高。Burks 等[49]則認(rèn)為重復(fù)多次聯(lián)合應(yīng)用脈沖聚焦超聲與干細(xì)胞(MSCs、EPC)能提高干細(xì)胞向肌肉歸巢量。白園園等[50]進(jìn)一步利用UTMD 提高 MSCs 靜脈移植的效率，給大鼠頸靜脈輸注微泡及 Brdu 標(biāo)記的 MSCs，在下肢給予 1.9 W/cm2超聲輻照 180 s 發(fā)現(xiàn)，血管壁及血管外可見更多的 Brdu 陽性細(xì)胞。但因肌肉骨骼損傷的修復(fù)是一個長期的過程，UTMD 技術(shù)向臨床應(yīng)用過渡還需要更長時間的隨訪及更完善的安全性評估。

3.2 超聲波聯(lián)合干細(xì)胞治療心血管疾病

目前已知移植干細(xì)胞到達(dá)心臟能發(fā)揮治療作用，通過緊密連接的血管內(nèi)皮層是其關(guān)鍵[51]。UTMD 技術(shù)能提高干細(xì)胞移植中的靶向歸巢、促進(jìn)心功能改善。UTMD 在大鼠[29]、雜交犬[30]、新西蘭兔[31,32]的心肌梗死模型的應(yīng)用中，均能顯著提高 MSCs 向心肌靶向歸巢的效率。此外，雖然 UTMD 對 MSCs 的增殖和凋亡活動無影響，但卻能顯著提高 CXCR4、SDF-1、VEGF 等相關(guān)遷移因子的表達(dá)，促使毛細(xì)血管密度增加和心臟功能改善[29]。Kuliszewski 等[52]在慢性下肢缺血的大鼠模型中應(yīng)用超聲介導(dǎo)載 SDF-1 質(zhì)粒微泡破壞能靶向傳遞 EPCs 到血管內(nèi)皮，提高 EPCs 的局部移植成活率。UTMD 介導(dǎo) SDF-1 基因轉(zhuǎn)染與 EPCs 聯(lián)合顯著改善血管灌注與毛細(xì)血管的密度，為基因治療提供了新的治療策略。

3.3 超聲波聯(lián)合干細(xì)胞治療泌尿系統(tǒng)疾病

由于活體動物腎臟血供豐富，血流的“散熱效應(yīng)”會帶走由超聲波熱效應(yīng)所產(chǎn)生的熱量，導(dǎo)致活體腎組織對超聲能量的反應(yīng)與離體組織比較可能有明顯的差別[53]。有研究表明，采用無創(chuàng)脈沖聚焦超聲對小鼠的一側(cè)腎臟進(jìn)行輻照時，對組織所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)會引起局灶性、暫時性趨化因子的升高。而脈沖聚焦超聲引起的細(xì)胞因子的上調(diào)會在治療后約 1 天出現(xiàn)，3 天后恢復(fù)到對側(cè)腎的水平，合理利用此時間窗進(jìn)行 MSCs靜脈注射能顯著提高其靶向歸巢的能力[54]。另外，MSCs 移植直接分化成腎小管上皮細(xì)胞、促進(jìn)腎小管壞死后上皮細(xì)胞的修復(fù)與再生的作用可能有限[55]。而 UTMD 技術(shù)能改變腎臟局部微環(huán)境，使細(xì)胞膜通透性增加及內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬，MSCs 可通過破裂的微血管和細(xì)胞間隙到達(dá)組織細(xì)胞內(nèi)，從而提高腎臟靶向傳輸 MSCs的能力。在活體研究中，UTMD 對急性腎小管壞死[56]、糖尿病腎病[57,58]均具有較好的治療效果，而在治療慢性細(xì)菌性前列腺炎[59]中也有相關(guān)研究。

3.4 超聲波聯(lián)合干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病

有報道[60]指出，低強(qiáng)度超聲能通過刺激雪旺細(xì)胞的增殖及髓鞘的再生而間接促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的再生和神經(jīng)功能的恢復(fù)，聯(lián)合 iPSCs-NCSCs或其他生物材料為治愈周圍神經(jīng)損傷帶來可能。翟翠靜等[61]通過剪斷 T8 脊髓制作 SD 大鼠脊髓損傷模型，NSCs 移植聯(lián)合應(yīng)用低強(qiáng)度超聲波能促進(jìn)損傷脊髓運(yùn)動和傳導(dǎo)功能的部分恢復(fù)。可能是低強(qiáng)度超聲波通過改善損傷脊髓局部微環(huán)境，創(chuàng)造利于 NSCs 生長分化的條件而促進(jìn)了大鼠損傷脊髓功能的部分恢復(fù)。但結(jié)果遠(yuǎn)未達(dá)到正常狀態(tài)水平，提示在脊髓損傷的神經(jīng)干細(xì)胞移植方面還需要更深、更細(xì)的進(jìn)一步研究。

4 超聲成像在干細(xì)胞治療中的應(yīng)用進(jìn)展

干細(xì)胞成像對于再生醫(yī)學(xué)中的監(jiān)測和評價療效過程是不可或缺的。目前干細(xì)胞成像的方法主要包括磁共振成像、單光子發(fā)射性計(jì)算機(jī)斷層顯像、光學(xué)成像(亮子點(diǎn)、熒光成像和生物發(fā)光)以及超聲成像等。在超聲成像中，靶組織相對于背景的低對比度是一個關(guān)鍵限制因素。Chen 等[62]描述了一種新型的杯形二氧化硅(SiO2)納米粒子，可在再生醫(yī)學(xué)成像中對標(biāo)記的干細(xì)胞有顯著的超聲阻抗不匹配現(xiàn)象。通過將這種新結(jié)構(gòu)與超聲中使用的其他二氧化硅結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)外泌體樣二氧化硅納米粒子會造成增強(qiáng)的干細(xì)胞超聲信號應(yīng)答，且標(biāo)記的濃度下并沒有檢測到細(xì)胞毒性。其中，外泌體樣二氧化硅納米粒子有可能在干細(xì)胞示蹤中得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)前干細(xì)胞在體內(nèi)遷移、作用的動態(tài)可視化依然具有很大挑戰(zhàn)。光聲成像技術(shù)是一種新興的、無損的光學(xué)技術(shù)與超聲技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)，具有較大的穿透深度、較高的圖像對比度和分辨率[63]。Kim 等[64]使用普魯士藍(lán)納米顆粒有效標(biāo)記人體間充質(zhì)干細(xì)胞(如圖 2)，使其具有更好的光聲對比，體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)長達(dá)兩周的持續(xù)成像。在體研究[65]表明，治療創(chuàng)傷性腦損傷中應(yīng)用經(jīng)修飾過的普魯士藍(lán)標(biāo)記的骨髓造血干細(xì)胞能夠成功追蹤干細(xì)胞在創(chuàng)傷恢復(fù)過程中的遷移，過程中腦部出血情況可被光聲成像技術(shù)清晰顯像及持續(xù)性監(jiān)測。Qin等[66]成功設(shè)計(jì)了一種具有光聲效應(yīng)的有機(jī)半導(dǎo)體納米粒子，并將該納米粒子用于誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的活體細(xì)胞標(biāo)記，成功解決了其難以被標(biāo)記的難題。由于光聲模式具有非常高的成像信噪比和對比度，該技術(shù)可以準(zhǔn)確判斷和量化移植成功的干細(xì)胞，而普通超聲成像則不具備這種能力。在未來，加強(qiáng)對超聲成像與其他工程技術(shù)結(jié)合的研究，將會成為突破干細(xì)胞示蹤研究的關(guān)鍵。

圖2 光聲成像體內(nèi)普魯士藍(lán)納米顆粒標(biāo)記的間充質(zhì)干細(xì)胞[64]Fig. 2 Photoacoustic imaging of mesenchymal stem cells labeled with prussian blue nanoparticles in vivo[64]

5 超聲在干細(xì)胞治療中參數(shù)應(yīng)用參考

根據(jù)現(xiàn)有報道，將聯(lián)合干細(xì)胞治療中不同參數(shù)的超聲總結(jié)在表 1 中供讀者參考。

6 結(jié)論和展望

綜上所述，超聲波可刺激體外培養(yǎng)的干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化、遷移以及維持細(xì)胞活性，緩解種子細(xì)胞來源不足、分化成熟和移植效率低等問題。超聲靶向微泡破壞技術(shù)(UTMD)作為近年來新興的技術(shù)，在干細(xì)胞移植、靶向藥物遞送以及基因轉(zhuǎn)染的研究中具有較好的應(yīng)用前景。

但超聲波在干細(xì)胞治療中要從基礎(chǔ)研究走到大規(guī)模臨床應(yīng)用，還有很長的路要走。該研究領(lǐng)域目前還存在以下問題：(1)上述低強(qiáng)度超聲波對 MSCs 與腫瘤干細(xì)胞的效應(yīng)各異，說明低強(qiáng)度超聲波對干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)未被充分了解，其應(yīng)用于干細(xì)胞治療還需要對分子、通路、基因等更深層次的機(jī)制進(jìn)行研究；(2)聯(lián)合超聲與干細(xì)胞治療的研究尚處于初步階段，文獻(xiàn)報道的質(zhì)量參差不齊，需要更多的活體或大型動物疾病模型進(jìn)行研究，逐步向臨床應(yīng)用過渡；(3)超聲波強(qiáng)度不同對干細(xì)胞產(chǎn)生的影響也不同，因此超聲波的參數(shù)選擇是有效治療的關(guān)鍵，而各文獻(xiàn)中報道的參數(shù)應(yīng)用不一致，超聲波儀器生產(chǎn)廠商亦各不同，尚待更多參數(shù)優(yōu)化的研究，為超聲聯(lián)合干細(xì)胞治療提供指導(dǎo)；(4)超聲波對干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)能力的影響報道較少，尚無足夠證據(jù)證明長期應(yīng)用超聲波輻照移植干細(xì)胞不產(chǎn)生體內(nèi)免疫排斥反應(yīng)，所以這方面研究亟待深入；(5)UTMD 的安全性尚存在爭議，有研究[67]報道超聲介導(dǎo)微泡破壞的參數(shù)選擇過高導(dǎo)致心功能障礙伴 ST 段抬高，在增強(qiáng)靶向性和減少不良反應(yīng)發(fā)生的前提下，該技術(shù)需要進(jìn)一步研究優(yōu)化。

表1 超聲在干細(xì)胞治療學(xué)中參數(shù)選擇參考Table 1 The reference of ultrasonic parameter selection in stem cell therapy

相信隨著研究的深入，超聲波在干細(xì)胞治療學(xué)中的應(yīng)用將越來越廣泛，成為輔助干細(xì)胞治療的有用工具，甚至可以與其他工程技術(shù)結(jié)合以獲得更好的療效。