穩(wěn)定同位素技術(shù)在農(nóng)產(chǎn)品安全中的應(yīng)用研究進(jìn)展

靳欣欣，潘立剛，李 安

（北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100097）

俗話說(shuō)，民以食為天，隨著人們生活水平的提高，農(nóng)產(chǎn)品安全也成為社會(huì)輿論關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著安全事件頻發(fā)及國(guó)家有關(guān)方面的重視，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的要求也越來(lái)越高，作為近年來(lái)發(fā)展較快的檢測(cè)技術(shù)。穩(wěn)定同位素質(zhì)譜具有高靈敏度、低檢測(cè)限的特點(diǎn)，在農(nóng)品產(chǎn)地溯源及摻雜、鑒別中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。其獨(dú)特的原理也使其獲得獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，如葡萄酒中摻入甘油，單花蜜中摻入雜花蜜等摻假鑒別；有機(jī)食品與非有機(jī)食品的鑒別等。

穩(wěn)定同位素技術(shù)一直主要應(yīng)用于產(chǎn)地溯源和摻雜判別，近年來(lái)關(guān)于農(nóng)田環(huán)境中有機(jī)污染物的來(lái)源追溯、降解機(jī)理、轉(zhuǎn)化途徑及量化轉(zhuǎn)化程度方面的研究也在陸續(xù)開(kāi)展。

1 穩(wěn)定同位素質(zhì)譜的基本原理概述

相同元素的原子中，由于原子核含有的中子數(shù)目不同，這些原子被稱為同位素，其中包括穩(wěn)定同位素和放射性同位素。穩(wěn)定同位素，不具有放射性，在研究中比較安全，針對(duì)穩(wěn)定同位素的檢測(cè)的應(yīng)用也日益廣泛[1]，如1H和2H，12C和13C，16O、17O和18O。

穩(wěn)定同位素質(zhì)譜（Isotope Ratio Mass Spectrometry，IRMS）即所檢測(cè)的樣品中目標(biāo)元素穩(wěn)定同位素的豐度（以原子百分計(jì)的同位素的相對(duì)含量）。在自然界中，生物體與其所在環(huán)境會(huì)進(jìn)行物質(zhì)交換，其同位素組成會(huì)因此發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為同位素分餾，也是造成不同來(lái)源物質(zhì)中同位素差別的原因，可以視為外界環(huán)境對(duì)生物體打下的特征印跡[2]。利用該原理，IRMS技術(shù)可以開(kāi)展來(lái)源追溯、降解機(jī)理、轉(zhuǎn)化途徑及量化轉(zhuǎn)化程度等方面的研究。在具體的測(cè)定中，使用國(guó)際公用的參照標(biāo)準(zhǔn)物的相對(duì)量來(lái)表示同位素的富集程度，表達(dá)式[3]為：

式（1-1）和（1-2）中，δ‰表示穩(wěn)定同位素的比率，R樣品表示測(cè)定樣品中重同位素和輕同位素豐度比，R標(biāo)準(zhǔn)表示國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素和輕同位素豐度比。

表1 常見(jiàn)同位素的分餾原因及其在食品溯源中的應(yīng)用

2 穩(wěn)定同位素技術(shù)在產(chǎn)地溯源和有機(jī)判別中的應(yīng)用

不同產(chǎn)地和生長(zhǎng)環(huán)境的農(nóng)產(chǎn)品，在生長(zhǎng)過(guò)程中受不同的外界環(huán)境影響，吸收不同來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些都會(huì)使農(nóng)產(chǎn)品發(fā)生同位素分餾，產(chǎn)生具有產(chǎn)地特性的特征值，也是進(jìn)行產(chǎn)地溯源及真?zhèn)舞b別的基本原理。常應(yīng)用的幾種同位素的分餾原因及其指示信息[3]見(jiàn)表1。

在穩(wěn)定同位素技術(shù)中，產(chǎn)地溯源和摻雜鑒別在農(nóng)產(chǎn)品安全中應(yīng)用最為廣泛，技術(shù)上也相對(duì)成熟，已有大量相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。在有機(jī)和非有機(jī)蔬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用也已有廣泛報(bào)道。

有機(jī)食品是國(guó)際上對(duì)天然、無(wú)污染食品統(tǒng)一的名稱，通常來(lái)自于有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)體系，根據(jù)國(guó)際有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要求和標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)加工。對(duì)于有機(jī)食品的認(rèn)證要求中包括生產(chǎn)基地在3年內(nèi)未使用過(guò)農(nóng)藥、化肥等違禁物質(zhì)，這點(diǎn)與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)大多使用化學(xué)合成肥料不同，后者可以根據(jù)植物不同生長(zhǎng)階段的需求提供其可以利用的營(yíng)養(yǎng)元素；因此，二者在肥料使用上差異較大，也正是這種不同的種植方式奠定了有機(jī)食品鑒別技術(shù)的基礎(chǔ)[4]。

IRMS法檢測(cè)H、C、N、O、S這些在植物組織中大量存在的元素，精密度可達(dá)0.01%～0.20%，且前處理過(guò)程較為簡(jiǎn)單；其中，研究認(rèn)可δ15N可作為植物不同肥料管理的研究參數(shù)，其被視為有機(jī)食品確證的潛在標(biāo)記物[5]。

李光德等[6]分析了北京郊區(qū)5個(gè)有機(jī)和1個(gè)常規(guī)蔬菜生產(chǎn)基地的蔬菜和土壤樣品，對(duì)其δ15N值進(jìn)行了測(cè)定并找尋規(guī)律特征，結(jié)果表明：有機(jī)生產(chǎn)時(shí)間和有機(jī)肥中氮投入增加，土壤全氮和δ15N都有一定的增加，且當(dāng)季農(nóng)作物對(duì)于肥料中δ15N反應(yīng)敏感，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)δ15N可作為蔬菜是否使用了化學(xué)合成氮肥檢測(cè)的“有效工具”，但同時(shí)應(yīng)結(jié)合生產(chǎn)記錄等措施進(jìn)行綜合判定。姚志鵬等[7]研究了不同施肥條件下土壤和萵苣不同部位的同位素特征變化情況，設(shè)置條件包括施有機(jī)肥、尿素和局部施尿素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：各肥料條件下土壤δ15N值與萵苣δ15N值的差異及變化規(guī)律為先升后降再趨平，但萵苣不同部位δ15N則存在一定規(guī)律性；總體上，萵苣內(nèi)葉和土壤δ15N值變化可以作為有機(jī)蔬菜種植過(guò)程中氮肥的使用種類的鑒別指標(biāo)。除了δ15N，δ18O也可被結(jié)合利用測(cè)定二維同位素值來(lái)進(jìn)行鑒別。Mihailova等[8]發(fā)現(xiàn)，在生菜、番茄、馬鈴薯的種植中，施用有機(jī)肥料的δ15N較化學(xué)合成肥料的δ15N為高，而δ18O則明顯為低，這種氮氧二維同位素的鑒別方法準(zhǔn)確度可達(dá)84.8%。

3 穩(wěn)定同位素在農(nóng)田環(huán)境中的應(yīng)用

因?yàn)檗r(nóng)田環(huán)境的復(fù)雜性，穩(wěn)定同位素技術(shù)的應(yīng)用受到限制，單體同位素分析（Compound-Specific Isotope Analysis，CSIA）及更進(jìn)一步的二維（2-D CSIA）到多維（MD CSIA）單體同位素分析技術(shù)拓展了其在該領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

CSIA技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展成熟的一門(mén)現(xiàn)代化分析技術(shù)[9]，是將氣相色譜與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀聯(lián)用，利用了色譜的分離能力，將樣品中的目標(biāo)化合物分離之后再進(jìn)行同位素檢測(cè)，被檢測(cè)的同位素可以是一種元素，也可以是2種或多種元素，即為二維單體同位素分析和多維單體同位素分析。CSIA技術(shù)能測(cè)定單個(gè)化合物中特定元素的同位素比率組成，不會(huì)受其他化合物干擾，大大提高了測(cè)定結(jié)果的可靠性，然而農(nóng)田環(huán)境的復(fù)雜性仍可能造成目標(biāo)化合物的濃度與被測(cè)單體同位素改變的非線性波動(dòng)，其濃度減小并不意味著目標(biāo)物的消除，引起濃度變化的原因也不能夠肯定[10]，而2-D CSIA和MD CSIA可進(jìn)一步克服這個(gè)缺陷。

3.1 來(lái)源追溯

有機(jī)化合物進(jìn)入環(huán)境中時(shí)有自己的特征同位素組成，在特定的環(huán)境領(lǐng)域，若化合物同位素組成保持不變，可直接利用其同位素組成進(jìn)行來(lái)源示蹤[11]。某些有機(jī)化合物的同位素組成在環(huán)境中會(huì)發(fā)生規(guī)律性的變化，反應(yīng)物中由輕同位素（12C）形成的分子鍵的鍵力較弱，反應(yīng)速率高于由重同位素（13C）形成的分子，導(dǎo)致在生成物中的重同位素逐漸富集（偏正），而反應(yīng)物的重同位素逐漸貧化（偏負(fù)）[12]。以此可進(jìn)行農(nóng)田環(huán)境污染物的來(lái)源追溯。

農(nóng)業(yè)流域非點(diǎn)源污染[13]主要為農(nóng)村生活和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的呈非點(diǎn)狀形式擴(kuò)散和排放的污染物，其對(duì)水域造成的污染問(wèn)題的日益突出已使農(nóng)村污染河網(wǎng)水系水質(zhì)的提升及水體修復(fù)被國(guó)家列為當(dāng)前流域管理和農(nóng)村可持續(xù)發(fā)展的主要工作方向之一[14]，要解決這一問(wèn)題，需要對(duì)農(nóng)業(yè)流域進(jìn)行有效管理，并解析污染來(lái)源。

硝態(tài)氮是農(nóng)業(yè)流域的一大類污染源，基于15N-18O雙穩(wěn)定同位素的硝酸鹽追溯技術(shù)是目前的主流方向。Harden等[15]通過(guò)在美國(guó)農(nóng)業(yè)小流域開(kāi)展有機(jī)肥和傳統(tǒng)化肥對(duì)流域水質(zhì)影響差異的試驗(yàn)，結(jié)果表明：施加有機(jī)肥所在流域水體硝酸鹽的δ15N高于施加傳統(tǒng)化肥的δ15N，但硝酸鹽的δ18O并無(wú)明顯差異。Liu等[16]則是發(fā)展了15N-17O-18O三穩(wěn)定同位素法，強(qiáng)化了對(duì)于黃河水體硝酸鹽來(lái)源的解析能力，結(jié)果表明：黃河中的硝酸鹽污染源7%來(lái)源于未經(jīng)處理的大氣，陸源污染則在不同流域有不同的主要污染來(lái)源。Lu等[17]結(jié)合15N-18O的穩(wěn)定同位素值與貝葉斯模型（SIAR）研究了三江平原農(nóng)業(yè)集約化對(duì)于水體污染源的影響，結(jié)果表明：在豐水期污染源主要為化學(xué)肥料和土壤氮肥，枯水期污染源主要為糞便和污水。

3.2 降解研究

污染物在進(jìn)入環(huán)境之后，可通過(guò)物理、化學(xué)、生物作用自然衰減，包括降解作用與非降解作用兩部分。其中非降解作用包括揮發(fā)、擴(kuò)散、吸附等，在這一過(guò)程中，污染物結(jié)構(gòu)并不發(fā)生變化；降解作用主要指化學(xué)和生物降解，在降解過(guò)程中會(huì)使得污染物化學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變[18]，降解作用有從本質(zhì)上去除污染物的有效作用，其速率是自然衰減消除污染物的關(guān)鍵，而通常只有化學(xué)鍵的斷開(kāi)或者形成，才能使有機(jī)化合物的同位素產(chǎn)生明顯的分餾[19-20]，CSIA可根據(jù)同位素分餾識(shí)別并量化生物降解作用，已成為自然衰減降解監(jiān)測(cè)的重要技術(shù)。

多環(huán)芳烴是一類環(huán)境中廣泛存在的有毒有機(jī)化合物，由2個(gè)或以上的苯環(huán)以線性排列、彎曲連接或聚簇狀的方式構(gòu)成，具有致畸、致癌、致突變的作用[21]。農(nóng)田土壤中的多環(huán)芳烴主要來(lái)源于大氣污染、污水灌溉、污泥等[22]，其微生物降解機(jī)理是一大研究熱點(diǎn)。焦杏春等[23]應(yīng)用單體碳同位素分析技術(shù)對(duì)農(nóng)田土壤中的多環(huán)芳烴的植物降解過(guò)程進(jìn)行了定量表征，結(jié)論表明：玉米根對(duì)土壤的多環(huán)芳烴有一定的清除作用，3環(huán)以下的多環(huán)芳烴更傾向于被降解和清除。將穩(wěn)定同位素標(biāo)記的目標(biāo)化合物添加入環(huán)境樣品中，結(jié)合分子生物學(xué)手段進(jìn)行微生物群體和個(gè)體之間穩(wěn)定同位素的流動(dòng)的方法稱為穩(wěn)定同位素探針（Stable isotope probing，SIP）技術(shù)[24]，應(yīng)用于研究污染物的微生物降解機(jī)理，具有廣闊的發(fā)展前景[25]。Guitierrez等[26]在坦帕灣的藻花上驗(yàn)證了全標(biāo)記萘為基質(zhì)運(yùn)用的DNA-SIP技術(shù)可以從海水中鑒定出萘降解菌。Zhang等[27]則應(yīng)用DNA-SIP從受污染水域的底泥中鑒定出了3種蒽降解菌。

穩(wěn)定同位素在其他農(nóng)田污染物降解中的應(yīng)用有：錢(qián)毅光[28]研究了有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑六氯環(huán)己烷厭氧條件下降解過(guò)程的碳同位素分餾特征與降解機(jī)理，并對(duì)比分析了六氯環(huán)己烷不同對(duì)映異構(gòu)體的降解特征，驗(yàn)證了穩(wěn)定同位素分析與對(duì)映體同位素分析技術(shù)結(jié)合使用來(lái)研究環(huán)境中有機(jī)對(duì)映體污染物的微生物降解轉(zhuǎn)化路徑與機(jī)理的有效性。Uhlik等[29]利用DNA-SIP技術(shù)對(duì)被多氯聯(lián)苯和多環(huán)芳烴復(fù)合污染的土壤進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)土壤中的苯甲酸鹽降解菌和聯(lián)苯降解菌同樣可以萘為碳源進(jìn)行代謝，揭示了土壤微生物寬泛的生物降解能力。

3.3 轉(zhuǎn)化途徑

在有機(jī)污染物的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，同位素分餾的分餾值大小在很大程度上取決于斷裂或形成鍵的類型以及過(guò)渡態(tài)化學(xué)鍵斷裂或形成的程度；以δ13C為例，利用瑞利方程來(lái)表征反應(yīng)殘留物與反應(yīng)起始物的關(guān)系。

式（3-1）中，f代表殘留分?jǐn)?shù)，Cx和Co代表反應(yīng)殘留物與起始物的同位素值(13C/12C)，ε為降解系數(shù)，α為分餾因子（α=KIE-1），ε=1 000×（α－1）[30]。

Kuder等[31]通過(guò)研究并計(jì)算出了有機(jī)污染物甲基叔丁基醚厭氧降解過(guò)程中碳、氫同位素的分餾因子，通過(guò)與已知的C-O鍵和C-H鍵數(shù)值相比，斷定出甲基叔丁基醚轉(zhuǎn)化的第一步是酶促水解C-O鍵斷裂而非C-H鍵斷裂。

由于CSIA評(píng)價(jià)有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化通過(guò)污染物的碳、氫信號(hào)來(lái)判定，而13C、2H在污染物中是平均分布的，只有反應(yīng)位點(diǎn)的13C、2H具有活性；因此使用具體反應(yīng)位點(diǎn)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)（AKIE）更為準(zhǔn)確。

式（3-2）中，εrp為具體反應(yīng)點(diǎn)AKIE的降解系數(shù)[32]。

Zwank等[33]計(jì)算了甲基叔丁基醚厭氧降解過(guò)程中碳、氫的AKIE，與預(yù)期親核取代反應(yīng)的AKIE值吻合，表明這一轉(zhuǎn)化過(guò)程屬于SN2反應(yīng)機(jī)理。

4 小結(jié)

穩(wěn)定同位素技術(shù)憑借其獨(dú)特的技術(shù)原理，在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源和摻雜鑒別方面中有突出優(yōu)勢(shì)與無(wú)可替代的地位，針對(duì)當(dāng)前的一些棘手的食品安全事件也可以有效地解決，比如三聚氰胺非法添加奶粉[34]，以及進(jìn)口橄欖油、中藥材、茶葉等的產(chǎn)地溯源與真?zhèn)舞b別，穩(wěn)定同位素技術(shù)均可擴(kuò)展到不同的應(yīng)用領(lǐng)域[35]，尤其是現(xiàn)在大熱的有機(jī)食品鑒別，為將來(lái)研究發(fā)展的一個(gè)熱點(diǎn)。

穩(wěn)定同位素在農(nóng)田環(huán)境方面的應(yīng)用，包括了污染物溯源、降解研究和轉(zhuǎn)化機(jī)理等，依靠與色譜分離能力結(jié)合的單體和多維單體同位素分析技術(shù)，極大地?cái)U(kuò)展了其應(yīng)用領(lǐng)域并提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度；同時(shí)與其他學(xué)科的聯(lián)合應(yīng)用，包括與分子生物學(xué)聯(lián)合的穩(wěn)定同位素探針技術(shù)在土壤生物降解方面的應(yīng)用及在物理化學(xué)和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)上探尋污染物轉(zhuǎn)化機(jī)理的應(yīng)用，其都是未來(lái)穩(wěn)定同位素技術(shù)發(fā)展的方向。