阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A形成機(jī)制研究及其制備

許樂義

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阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A形成機(jī)制研究及其制備

許樂義

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310000）

對形成阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步探究，并對其克級樣品的制備進(jìn)行了首次嘗試。通過對實(shí)驗數(shù)據(jù)的分析，形成組分A的主要原因來自于阿卡波糖的異構(gòu)化，而且該過程對于菌絲體的參與并不依賴。針對于這一發(fā)現(xiàn)，建立了對阿卡波糖進(jìn)行異構(gòu)化反應(yīng)，從而獲得組分A的獲取方法，并通過不斷試驗得到了使組分A達(dá)到最高獲得率的條件數(shù)據(jù)。通過對中性氧化鋁以及強(qiáng)酸型陽離子交換的層析，從異構(gòu)化的反應(yīng)液中獲得了高純度的組分A，為發(fā)酵液中雜質(zhì)組分A的去除分離等后續(xù)系統(tǒng)的研究提供了材料。

阿卡波糖；結(jié)構(gòu)類似物；發(fā)酵液；脫色專用樹脂

本文對形成雜質(zhì)組分A的機(jī)制進(jìn)行嘗試性的解析，并在此基礎(chǔ)上，對如何制備組分A進(jìn)行方法探究并建立相應(yīng)規(guī)則，以期獲得組分A在克級上的標(biāo)本，對于發(fā)酵液中雜質(zhì)組分A的去除分離等后續(xù)系統(tǒng)的研究提供了材料。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

試驗研究所需要的材料包括阿卡波糖、相關(guān)填料、中性層析氧化鋁、WD-脫色專用樹脂、色譜純已腈等；所需要的儀器設(shè)備主要包括高效液相色譜儀、高壓層析系統(tǒng)等。這些材料都可通過采購獲得。

1.2 組分A的制備

1.2.1 pH值因素

分別采用定量的HC1溶液和NaOH溶液用以對阿卡波糖溶液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，以使配置出來的阿卡波糖溶液是標(biāo)準(zhǔn)的。配置好標(biāo)準(zhǔn)溶液之后，在設(shè)定好的外界輔助條件的配合下，對其進(jìn)行異構(gòu)反應(yīng)，并在過程中進(jìn)行取樣，以便于對阿卡波糖的含量和雜質(zhì)A的含量進(jìn)行檢測。

1.2.2 溫度因素

僅使用NaOH溶液對阿卡波糖溶液進(jìn)行pH值調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)至一定的pH值之后，在設(shè)定好的外界輔助條件的配合下，對其進(jìn)行異構(gòu)反應(yīng)，并在過程中進(jìn)行取樣，以便于對阿卡波糖的含量和雜質(zhì)A的含量進(jìn)行檢測。

1.3 組分A的分離

1.3.1 Macro-prcp High S柱層析

在層析柱中填充一定的強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的床體積，并將其在高壓層析系統(tǒng)上進(jìn)行固定。用超純水對填充柱進(jìn)行充分平衡后，以相應(yīng)的流速將定量、經(jīng)過樹脂進(jìn)行脫色和微濾處理過的轉(zhuǎn)化液泵入強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂填充柱中；進(jìn)行樣本化，并用超純水對其進(jìn)行淋洗，直至基線趨于平穩(wěn)；用HC1溶液對其進(jìn)行繼續(xù)洗脫，并對洗脫液進(jìn)行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應(yīng)含量。

1.3.2 中性氧化鋁柱層析

通過濕法的方法，將中性氧化鋁的粉末按照一定量的標(biāo)準(zhǔn)裝進(jìn)層析柱中，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的床體積，并將其在高壓層析系統(tǒng)上進(jìn)行固定。經(jīng)超純水對填充柱進(jìn)行充分的平衡之后，以相應(yīng)的流速將定量的上述洗脫液泵入相應(yīng)的中性氧化鋁的填充柱中；進(jìn)行樣本化，并用超純水對其進(jìn)行淋洗，直至基線趨于平穩(wěn)；使用超純水對其進(jìn)行繼續(xù)洗脫，并對洗脫液進(jìn)行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應(yīng)含量。

1.3.3 冷凍干燥

經(jīng)過上述過程得到洗脫液后，對其中含有較高組分A的洗脫液進(jìn)行合并，然后通過減壓濃縮的方式去除部分水分，并按照標(biāo)準(zhǔn)對其進(jìn)行相應(yīng)時長的冷凍，最后通過對其進(jìn)行冷凍干燥的方法，獲得組分A的樣品。

1.4 分析方法

1.4.1 對阿卡波糖進(jìn)行測定的方法

利用水膜對樣品進(jìn)行微濾之后，對其進(jìn)行相應(yīng)檢測，檢測按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.4.2 對組分A進(jìn)行測定的方法

檢測按照歐洲藥典的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 通過異構(gòu)化反應(yīng)對組分A進(jìn)行制備

2.1.1 LC-MS分析

在標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定條件下，對阿卡波糖溶液進(jìn)行一段時間的處理；在反應(yīng)液中會有4類物質(zhì)生成，將其分別標(biāo)注為Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)、Ⅳ類物質(zhì)。通過對反應(yīng)液進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析后發(fā)現(xiàn)，殘留在反應(yīng)液中的阿卡波糖的相對分子量等同于Ⅳ類物質(zhì)的相對分子量，由此證明Ⅳ類物質(zhì)為阿卡波糖的同分異構(gòu)體。同時，在出峰時間上進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，相比于阿卡波糖，組分A是其0.9倍，并對保留時間進(jìn)行參考比較，得出了Ⅳ類物質(zhì)即為雜質(zhì)組分A的結(jié)論。這也從側(cè)面論證了形成組分A的原因之一就是阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)，且在此過程中，可能并不依賴于菌絲體參與。

2.1.2 阿卡波糖異構(gòu)化反應(yīng)中pH值的影響

經(jīng)大量實(shí)驗表明，pH值對反應(yīng)液中通過阿卡波糖異構(gòu)化的作用生成組分A在效率上有明顯的影響。通過對實(shí)驗數(shù)據(jù)的分析觀察到，當(dāng)pH等于11時，通過異構(gòu)化的反應(yīng)可獲得最多的組分A，并在3 h內(nèi)異構(gòu)化的反應(yīng)趨于平衡，如圖1所示；當(dāng)pH等于12時，對于組分A的初反應(yīng)的形成速度是最快的，但反應(yīng)過程隨著時間的延長，組分A的含量出現(xiàn)逐步下降的情況，同時，Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)的生成含量相比于其他處理組織也呈現(xiàn)出明顯增多的現(xiàn)象。由此可以確定，在阿卡波糖異構(gòu)化的反應(yīng)過程中，pH值應(yīng)設(shè)定為11.

圖1 pH對阿卡波糖異構(gòu)化反應(yīng)的影響

2.1.3 異構(gòu)化的反應(yīng)過程中溫度的影響

經(jīng)過大量的實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，在一定的設(shè)定溫度區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的升高，對阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)用于生成組分A這一過程越來越有利，并對其反應(yīng)速度也有明顯的加速提升作用。這一溫度區(qū)間為30～70 ℃，通過對實(shí)驗數(shù)據(jù)的線性化曲線表現(xiàn)不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃之后，曲線趨于平穩(wěn)，溫度對反應(yīng)過程的影響開始變小。同時，對反應(yīng)過程中生成的Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)進(jìn)行了溫度影響的研究。研究數(shù)據(jù)表明，隨著溫度的升高，Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)的生成不斷加快，其中，Ⅱ類物質(zhì)受溫度影響的變化最為明顯，同樣，對其相應(yīng)的實(shí)驗數(shù)據(jù)進(jìn)行線性化，得到其二維曲線圖。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，在設(shè)定60 ℃和70 ℃溫度條件下，對于生成的組分A的含量進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)組分A的含量進(jìn)本持平，但是在對2個溫度下生成的3種雜質(zhì)含量進(jìn)行對比時發(fā)現(xiàn)，60 ℃下的生成量低于70 ℃下的生成量，由此可以確定，在阿卡波糖異構(gòu)化的反應(yīng)過程中，60 ℃為最優(yōu)反應(yīng)設(shè)定溫度。

2.1.4 異構(gòu)化的反應(yīng)過程中菌絲體的影響

經(jīng)實(shí)驗研究表明，在設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)外界輔助環(huán)境中，通過阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)獲得組分A的這一反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)自發(fā)進(jìn)行，但是存在著其異構(gòu)化反應(yīng)不是非常明顯的情況。通過在反應(yīng)液中分別添加菌絲體以及菌絲體裂解液，從而達(dá)到對轉(zhuǎn)化阿卡波糖這一過程的促進(jìn)作用，但這一方法對生成組分A的影響微乎其微。除此之外，對pH值進(jìn)行調(diào)整發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH等于11時，對通過阿卡波糖的異構(gòu)化反應(yīng)生成組分A這一反應(yīng)有明顯的強(qiáng)化作用。

2.2 對組分A的提取

2.2.1 Macro-prcp High S柱層析

由于組分A與阿卡波糖為同分異構(gòu)體，因此，阿卡波糖所含有的阿卡維基機(jī)構(gòu)其同分異構(gòu)體的組分A也同樣具有，在理論層面上，對組分A也同樣能夠通過陽離子交換樹脂的方法實(shí)現(xiàn)吸附分離。試驗中，通過使用強(qiáng)酸型陽離子交換劑實(shí)現(xiàn)對阿卡波糖以及組分A的吸附；采用HC1溶液洗脫的方法對其進(jìn)行處理。經(jīng)過對實(shí)驗的觀察以及對結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，組分A具有較弱的結(jié)合樹脂的能力，最先被洗脫，隨后Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)、Ⅲ類物質(zhì)被洗脫。利用離子交換層析的方法實(shí)現(xiàn)對Ⅰ類物質(zhì)、Ⅱ類物質(zhì)的去除，并使Ⅲ類物質(zhì)的含量降低，從而獲得去除雜質(zhì)的只包含阿卡波糖和組分A的洗脫液，但是這一方法不能夠?qū)崿F(xiàn)對阿卡波糖和組分A的分類。

2.2.2 中性氧化鋁柱層析

通過利用中性氧化鋁與組分A空間結(jié)構(gòu)不同的原理，嘗試?yán)弥行匝趸X層析柱實(shí)現(xiàn)對阿卡波糖以及組分A分離，效果明顯。實(shí)驗結(jié)果表明，這一方法可以有效地實(shí)現(xiàn)對阿卡波糖以及組分A的分離以及純度的提高。通過強(qiáng)酸型陽離子交換層析、中性氧化鋁層析方法分步驟實(shí)現(xiàn)了對組分A的樣品提取，為后續(xù)其相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)材料。

3 結(jié)束語

本文通過結(jié)合理論實(shí)驗以及對大量實(shí)驗數(shù)據(jù)的分析，得到了制備阿卡波糖結(jié)構(gòu)類似物組分A的制備原理，并獲得了相應(yīng)的克級樣本，為組分A的分類去除提供了參考，為組分A的制備提供了理論依據(jù)，為組分A的后續(xù)研究工作提供了樣本。

［1］王亞軍，董方智，于蕾，等.陽離子交換樹脂SAC 001×7對阿卡波糖的吸附性能研究［J］.高校化學(xué)工程學(xué)報， 2012（03）：493-498.

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2095－6835（2018）18－0136－02

TQ920.1

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.136

〔編輯：張思楠〕