黃瓜灰霉病拮抗菌7—16發(fā)酵液理化性質(zhì)的測(cè)定

楊迪

摘要：黃瓜灰霉病拮抗菌株7-16具有良好的抑菌效果，但理化性質(zhì)的穩(wěn)定性對(duì)后期的開發(fā)應(yīng)用有著至關(guān)重要的影響。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定其無菌發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的抑菌效果和穩(wěn)定性，它不僅對(duì)溫度、光照及酸堿度耐受性優(yōu)良，且發(fā)酵液有良好的耐貯存性。傳代試驗(yàn)也表明該菌株遺傳性能穩(wěn)定，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力保持了很高的水平。

Abstract： The antagonistic strains 7-16 of Botrytis cinerea have good antibacterial effect， but the stability of physicochemical properties has a crucial influence on the development and application of the later stage. The test showed that the aseptic fermentation broth showed good antibacterial effect and stability. It not only had excellent tolerance to temperature， light and pH， but also had good storage stability of the fermentation broth. Passage experiments also showed that the strain had stable genetic properties and the ability to produce antibacterial substances remained high.

關(guān)鍵詞： 拮抗放線菌；理化性質(zhì)；穩(wěn)定性；抑菌效果

Key words： antagonistic actinomycetes；physicochemical properties；stability；antibacterial effect

中圖分類號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2018）26-0191-02

1 文獻(xiàn)綜述

黃瓜灰霉病是流行性強(qiáng)，再侵染頻繁的病害，歷年發(fā)生為害嚴(yán)重，給黃瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。農(nóng)用抗生素（Agricultural antibiotics）是由微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生的、與農(nóng)藥有相同功能，可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，抑制作物病害、防止病蟲害威脅等的次生代謝產(chǎn)物。隨著科技的發(fā)展，人們的環(huán)保意識(shí)不斷提高。世界各國(guó)已經(jīng)意識(shí)到傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的危害，并已嚴(yán)格規(guī)范，制定嚴(yán)格的生產(chǎn)及使用要求，大量傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥已被禁止。生物農(nóng)藥的研究已經(jīng)是各國(guó)研究人員的重點(diǎn)研究對(duì)象。全球每年新研制和登記的生物農(nóng)藥品種正以4%的速度遞增 [1]。就目前的發(fā)展趨勢(shì)來看，傳統(tǒng)的生物農(nóng)藥勢(shì)必要被農(nóng)用抗生素代替。已研制開發(fā)的放線菌酮、井岡霉素、多抗霉素等[2]農(nóng)用抗生素，其效果已在實(shí)際應(yīng)用中獲得了很好的驗(yàn)證。

2 材料方法

2.1 材料

經(jīng)多重篩選得到的黃瓜灰霉病拮抗鏈霉菌菌7-16。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將黃瓜灰霉病拮抗鏈霉菌菌7-16發(fā)酵液分別進(jìn)行以下處理，測(cè)定其抑菌活性。

①熱穩(wěn)定性測(cè)定[3-4] 。

1）處理溫度為100℃，處理時(shí)間分別為10、30、60、120min。2）處理時(shí)間為30min，處理溫度分別為30、50、70、90、121℃。

②光照穩(wěn)定性測(cè)定[5]。

1）自然光照射，照射時(shí)間分別為3、6、12h。2）紫外光照射，照射時(shí)間分別為1、2、4h。

③酸堿穩(wěn)定性測(cè)定[6]。

分別用1.0mol/L HCl、1.0mol/L NaOH，分別將發(fā)酵液樣品調(diào)pH至2～11，進(jìn)行下列處理后。1）室溫處理，靜置24h。2）100℃水浴加熱，處理時(shí)間分別為10、30、60、120min。

④耐貯性測(cè)定 發(fā)酵液分別于54℃和-20℃保存15。

⑤遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將原始純化菌F1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，直至F5代，測(cè)定1～5代菌株抑菌活性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定

在熱處理時(shí)間相同的條件下，隨著溫度的升高，拮抗菌的抑菌活性逐漸下降。菌株7-16的發(fā)酵液在30℃下處理30min仍保持較好的抑菌活性，抑菌圈直徑為45.8mm，121℃下處理30min沒有抑菌活性（如圖1）。

菌株7-16在100℃下處理10min時(shí)，其抑菌圈直徑為42.0mm， 100℃處理120min抑菌活性喪失（如圖2）。其抑菌活性隨著處理時(shí)間的增加而逐漸下降。

3.2 對(duì)紫外光及自然光穩(wěn)定性測(cè)定

在紫外光照射1h、2h和4h后，菌株7-16的抑菌圈直徑分別為60.2mm、57.0mm和53.9mm，抑菌活性下降很小（如圖3）。菌株7-16在自然光照射12h后的抑菌圈直徑仍為60.0mm，活性沒有下降（如圖4）。發(fā)酵液無論是在自然光照射下，還是紫外光照射下，抑菌活性均未發(fā)生明顯下降，表明其具有良好的光照穩(wěn)定性。

3.3 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

拮抗菌7-16的發(fā)酵液對(duì)酸堿的耐受性較差。發(fā)酵液在偏酸性和中性的條件下活性較高。室溫下，菌株7-16的抑菌活性最大值出現(xiàn)在pH為6時(shí)，然后隨pH值的增大而減小；100℃熱處理時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)同一pH的發(fā)酵液抑菌活性逐漸下降，處理10min時(shí)，pH值為6的拮抗菌發(fā)酵液抑菌圈直徑為42.1mm。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌活性逐漸消失，熱處理1h和2h的發(fā)酵液完全沒有抑菌活性（如圖5）。

3.4耐貯性測(cè)定

拮抗菌株的發(fā)酵液經(jīng)-20℃、15d處理后，基本保持了原有的抑菌活性；而經(jīng)54℃處理的發(fā)酵液幾乎全部喪失抑菌活性。

3.5 遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

與出發(fā)菌株相比，菌株7-16傳代培養(yǎng)的發(fā)酵液抑菌效果稍有下降，但排除試驗(yàn)誤差，仍然表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳性。

4 結(jié)論

菌株7-16的無菌發(fā)酵液表現(xiàn)出了較好的抑菌效果和穩(wěn)定性，它不僅對(duì)溫度、光照及酸堿度耐受性優(yōu)良，且發(fā)酵液有良好的耐貯存性。傳代試驗(yàn)也表明該菌株遺傳性能穩(wěn)定，產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力保持了很高的水平，預(yù)示著該菌株在開發(fā)為生物農(nóng)藥方面有著很好的前景。

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