白首烏花多糖對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用

劉澤鑫，劉暢，錢和

（1.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁033000；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；3.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

白首烏（Cynanchum auriculatum）是一種中草藥，屬阿斯克雷皮亞科（Asclepiadaceae-Asclepiadoideae），主要分布于江蘇省濱?？h，其塊莖作為一種中藥，具有多種藥理作用。白首烏含有淀粉、糖、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素、氨基酸等多種人體必需營(yíng)養(yǎng)素和30多種微量元素[1]。藥理研究表明，該屬植物具有明顯的藥理作用，如免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤等[2-3]。白首烏乙醇提取物具有抗腫瘤活性，可抑制人腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞活性，可增強(qiáng)小鼠植入肉瘤的抑制作用[4]，對(duì)乙醇、吲哚美辛引起的胃損傷及組胺引起的胃酸分泌有明顯抑制效果[5-6]。白首烏提取物口服劑量為200 mg/kg時(shí)可對(duì)白化大鼠有較強(qiáng)的肝保護(hù)作用[7]。白首烏根多糖具有抗氧化作用，可通過(guò)降低酒精喂養(yǎng)小鼠血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平，預(yù)防小鼠酒精性肝損傷[8]，還可以通過(guò)提高細(xì)胞中抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和非酶抗氧化谷胱甘肽的含量，直接清除活性氧，提高細(xì)胞活力和膜的完整性，從而降低氧化應(yīng)激[9]。但是，目前大量的研究只聚焦于白首烏根部，對(duì)白首烏花的研究少之又少。

肝臟在調(diào)節(jié)生理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，并參與多種代謝物的貯存、分泌、解毒等重要功能。酒精性肝病是最常見的肝病，主要是過(guò)量飲酒造成的。在全球范圍內(nèi)，大約70%與酒精有關(guān)的死亡直接歸因于酒精性肝病[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于酒精消費(fèi)量的增加，中國(guó)居民酒精性肝病的發(fā)病率也有所上升[11]，目前已超過(guò)6.1%[12]。研究表明，酒精性肝病的發(fā)病和死亡速度較快，其惡化過(guò)程包括單純性脂肪變性、進(jìn)行性脂肪變性、纖維化、肝硬化以及肝癌[10]。酒精性肝病也可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥和高血壓等許多并發(fā)癥[13]。已有學(xué)者證明，氧化應(yīng)激是酒精性肝病的主要原因之一，其機(jī)制可能是在酒精代謝的過(guò)程中，活性氧（reac tive oxygen species，ROS）不斷地生成[14-15]，當(dāng)體內(nèi)的ROS不能及時(shí)地被抗氧化酶系統(tǒng)清除時(shí)[16]，如超氧化物歧化酶（SOD）的抗氧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），過(guò)量的 ROS 便可通過(guò)激活炎性細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18]。此外，過(guò)量的ROS也會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，升高血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），進(jìn)一步地導(dǎo)致血脂異常和肝細(xì)胞損傷[19]。

本文通過(guò)超聲波輔助技術(shù)提取白首烏花多糖，并探究其體外抗氧化活性。通過(guò)構(gòu)造慢性加急性小鼠酒精性肝損傷模型，研究白首烏花多糖對(duì)小鼠酒精性肝損傷的保護(hù)作用，為白首烏花的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白首烏干花：江蘇鹽城；液體酒精飼料：南通特洛菲飼料科技有限公司。

腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein，HDL）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）等試劑盒：南京建成生物工程研究所。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R5002D恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；101A-3/3B電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠有限公司；SpectraMax全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices公司；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SJIA-10N冷凍干燥機(jī)：寧波東芝公司；T10組織勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白首烏花多糖的制備與測(cè)量

參考常用的多糖提取方法[20]，采用超聲儀（數(shù)字超聲波清洗機(jī)）對(duì)樣品進(jìn)行萃取，萃取溫度為80℃，時(shí)間為 80 min，水與原料的比例為 35 ∶1（mL/g）。萃取后，將萃取液體積濃縮至1/3原體積，然后用4倍體積95%乙醇4℃下沉淀過(guò)夜。最后，4 000 r/min低溫離心15 min，依此用75%乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮和無(wú)水乙醚充分洗滌沉淀物，以Sevage法除蛋白（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比），采用5 g/L活性炭脫色處理，得到粗多糖，透析袋透析多余成分，最后冷凍干燥即得白首烏花多糖，儲(chǔ)藏于-20℃冰箱。

1.3.2 DPPH自由基清除試驗(yàn)

參考說(shuō)明書的方法[21]，0.1 mL不同濃度的白首烏花多糖溶液（即 1 mg/mL～14 mg/mL）與 3.0 mL，0.1 mmol/L DPPH在甲醇中混合，混合溶液在室溫25℃黑暗中孵育30 min后，在517 nm吸光度下測(cè)定。試驗(yàn)中采用純甲醇作為空白溶液，IC50以mg/mL表示，DPPH自由基清除活性（%）的計(jì)算公式如下：

式中：A0為無(wú)樣品吸光度；A1為有樣品吸光度。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本文采用慢性加急性小鼠酒精性肝損傷模型[22]，30只8周齡雄性C57BL/6J小鼠（上海斯萊克，合格證編號(hào)2013001837097），飼養(yǎng)于江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，光照/暗循環(huán) 12 h，溫度（22±2）℃，濕度 50%～55%，倫理審查號(hào)：20181016-20181114【141】。首先，小鼠喂養(yǎng)液體飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為5組?？瞻捉M小鼠喂食正常的對(duì)照食物，模型組小鼠喂食含5%酒精的液體食物，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠飼喂5%酒精的液體食物并灌胃聯(lián)苯雙酯200 mg/kg，白首烏花多糖組小鼠每日分別灌胃200，400 mg/kg和5%酒精的液體食物，整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)11 d。在第11天，除空白組外，所有小鼠在給藥前的早上7點(diǎn)至9點(diǎn)給予50%的乙醇溶液（5 g/kg）。

第11天末次灌胃后，禁食9 h，麻醉處死小鼠。取眼球血樣，離心（4 000 r/min，10 min）得到血清。小鼠肝臟取出后用液氮立即凍結(jié)，組織保存于-80℃，待進(jìn)一步分析。

1.3.4 小鼠指標(biāo)檢測(cè)

1.3.4.1 小鼠體重、肝臟指數(shù)的測(cè)定

小鼠處死前稱重，取出小鼠肝臟，預(yù)冷生理鹽水洗凈，無(wú)菌濾紙拭干，稱其質(zhì)量。計(jì)算肝臟指數(shù)，公式如下：

1.3.4.2 肝臟病理學(xué)

對(duì)每個(gè)小鼠肝臟相同位置剪取部分組織，浸入4%多聚甲醛（磷酸鹽緩沖液溶解）中固定12 h，脫水處理，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色處理，切片風(fēng)干，并于倒置熒光顯微鏡下觀察肝組織情況。

1.3.4.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

眼眶取血后，血漿放置30 min，在3 000 r/min離心10 min，分離血清，4℃冰箱保存，3 d內(nèi)按照試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)血清 TC、TG、AST、ALT 活力、NEFA、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL）含量。

1.3.4.4 肝臟生化指標(biāo)檢測(cè)

取其余肝組織，用4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗并制備10%肝臟組織勻漿（生理鹽水制備），4℃，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，測(cè)定肝指標(biāo)，按照試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)GSH-Px活力、SOD活力、MDA含量、TNF-α以及IL-1β含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 16.0版本軟件統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sD）表示，用單因素方差分析，兩兩比較用Dunnett-t檢驗(yàn)，p＜0.05為顯著性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外DPPH自由基清除作用

任何延遲或抑制目標(biāo)分子氧化損傷的物質(zhì)都可以被認(rèn)為是抗氧化劑[23]?？寡趸瘎┑囊粋€(gè)主要特性是能夠捕獲自由基，清除過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脂質(zhì)等自由基[24]。DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一種相對(duì)自由的有機(jī)自由基，室溫下穩(wěn)定，廣泛用于測(cè)定初級(jí)抗氧化活性。當(dāng)DPPH溶于甲醇時(shí)，會(huì)產(chǎn)生紫色[25]。

采用DPPH法測(cè)定白首烏花提取物的抗氧化活性，結(jié)果為IC50，其值計(jì)算為活性為50%的提取物濃度（初始DPPH濃度降低50%）。白首烏花提取物的DPPH自由基清除活性見圖1。

圖1 白首烏花提取物的DPPH自由基清除活性Fig.1 DPPH radical scavenging activity of Baishouwu flowers extract

如圖1，計(jì)算白首烏花提取物-多糖的IC50值為（69.9±0.12）g/mL，維生素 C 的 IC50值為（33.44±0.05）g/mL，維生素C的活性是白首烏花活性的兩倍，說(shuō)明白首烏花多糖具有一定的體外抗氧化活性。以上結(jié)果表明，白首烏花多糖具有一定的體外抗氧化活性，其機(jī)制與清除自由基有關(guān)。

2.2 對(duì)小鼠體重和肝臟指數(shù)的影響

白首烏花多糖對(duì)小鼠體重、肝重量和肝指數(shù)的影響見表1。

表1 白首烏花多糖對(duì)小鼠體重、肝重和肝臟指數(shù)的影響Table 1 Effects of polysaccharides on the body weight，liver weight and liver index in mice

從表1中可以看出，白首烏花多糖低和高劑量組的初始體重與模型組沒(méi)有顯著差異。但是，比較模型組和空白組小鼠的肝臟指數(shù)，具有差異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白組體重增加量高于模型組，為22.92%（p<0.05），模型組最終體重下降16.55%，表明酒精可使小鼠體重下降。喂食小鼠白首烏花多糖400mg/kg和200mg/kg后，兩組小鼠體重分別下降10.91%和12.09%，表明白首烏花多糖可緩解酒精導(dǎo)致的小鼠體重下降。

模型組肝臟指數(shù)較空白組升高53.35%（p<0.05）。白首烏花多糖（400 mg/kg和200 mg/kg）干預(yù)后，與模型組相比，肝臟指數(shù)分別下降27.1%和27.62%（p<0.05）。結(jié)果表明，白首烏花多糖能抑制酒精導(dǎo)致的肝臟指數(shù)升高。

2.3 對(duì)小鼠肝臟病理學(xué)的影響

本文采用肝臟病理學(xué)來(lái)確定多糖對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。采用光鏡觀察染色后小鼠肝組織切片的病理學(xué)變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 白首烏花多糖對(duì)肝組織病理學(xué)變化的影響Fig.2 Effects of Baishouwu flowers polysaccharide on histopathological changes in liver tissues

空白組肝臟組織為正常肝臟結(jié)構(gòu)，見圖2A部分。相反，圖2B部分所示的模型組出現(xiàn)了嚴(yán)重的損傷，包括脂肪改變、形態(tài)不完整、壞死以及大面積出血。研究結(jié)果還表明，在低劑量和高劑量使用白首烏花多糖時(shí)，白首烏花多糖降低了肝臟組織對(duì)急性酒精毒性的變化，小鼠肝細(xì)胞排列整齊，僅可見少量雙核細(xì)胞，如圖2D、圖2E。值得注意的是，陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯處理對(duì)酒精性肝損傷有明顯的衰減作用，白首烏花多糖具有一定的劑量效應(yīng)。

2.4 對(duì)小鼠血清ALT、AST水平的影響

血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的活性常作為檢測(cè)早期肝損傷的生化指標(biāo)。這是因?yàn)楫?dāng)肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，它們可以從肝細(xì)胞中滲出進(jìn)入血液循環(huán)[26]。試驗(yàn)研究表明，急性酒精注射能夠成功地誘導(dǎo)肝損傷，其證據(jù)是血清ALT和AST活性的升高。白首烏花多糖對(duì)血清ALT活性和AST活性的影響見圖3。

如圖3所示，與空白組相比，酒精使小鼠血清ALT、AST水平顯著升高（p<0.05），說(shuō)明本研究成功建立了亞急性酒精性肝損傷模型。陽(yáng)性藥物可以預(yù)防血清ALT和AST水平的升高，對(duì)酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用，本研究表明，與模型組相比，在400 mg/kg白首烏花多糖的劑量下，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平分別降低了39.7%和30.3%。當(dāng)白首烏花多糖劑量為200 mg/kg時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平分別下降33.79%和25.37%。結(jié)果表明，白首烏花多糖對(duì)緩解酒精性肝損傷具有潛在的作用，并呈劑量依賴性。

圖3 白首烏花多糖對(duì)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性的影響Fig.3 Effects of Baishouwu flowers polysaccharide on hepatic parameter ALT activity and AST activity

2.5 對(duì)小鼠血清 TG、TC、HDL、LDL、NEFA的影響

多項(xiàng)研究表明酒精性肝損傷與高脂血癥有關(guān)，血脂的形成是過(guò)量飲酒最常見的反應(yīng)[27]。酒精代謝對(duì)血脂代謝的主要影響是高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥，過(guò)多的甘油三酯合成，血漿膽固醇酯化不良，以及高密度脂蛋白膽固醇水平降低[28]，肝臟指標(biāo)參數(shù)與血清指標(biāo)聯(lián)系是緊密的[29]。白首烏花多糖對(duì)血清中TG、TC、HDL、LDL和NEFA的影響見圖4。

圖4 白首烏花多糖對(duì)血清中甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和非酯化脂肪酸的影響Fig.4 Effects of Baishouwu flowers polysaccharide on blood parameter TG，TC，HDL，LDL and NEFA

本研究中，與模型組相比，何首烏花多糖組小鼠血清TG、TC、LDL明顯降低，HDL水平升高，這些結(jié)果表明肝細(xì)胞受損和血脂異常，何首烏花多糖對(duì)酒精誘導(dǎo)的肝指數(shù)有影響。與模型組相比，給予白首烏花多糖400 mg/kg劑量的小鼠TG、TC、LDL和NEFA水平分別顯著降低23.17%、26.63%、21.72%和41.05%（p＜0.05）。相反，高密度脂蛋白水平增加（28.42%）。當(dāng)白首烏花多糖劑量為200mg/kg時(shí)，血清中TG、TC、LDL、NEFA等指標(biāo)分別降低12.19%、24.5%、18.09%、17.45%（p＜0.05）。高密度脂蛋白水平升高21.85%（p＜0.05）。陽(yáng)性藥物組也有抑制TC、TG、LDL和NEFA升高的作用。上述結(jié)果表明，補(bǔ)充白首烏花多糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質(zhì)水平具有潛在的抑制作用。

2.6 對(duì)小鼠肝臟SOD、GSH-Px、MDA的影響

肝臟是機(jī)體代謝外源性藥物和內(nèi)源性分子的主要器官，其作用是維持機(jī)體代謝平衡，在碳水化合物、脂類、蛋白質(zhì)的代謝以及對(duì)外來(lái)生物和藥物的解毒方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，許多損傷會(huì)損害肝臟，可致肝內(nèi)平衡失調(diào)[30-31]。酒精性肝損傷是引起肝病最常見的原因之一，氧化應(yīng)激通過(guò)產(chǎn)生自由基和抗氧化防御的不平衡來(lái)誘導(dǎo)組織的損傷，在酒精性肝損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[32]。陽(yáng)性藥物聯(lián)苯雙酯通常用于治療肝炎，也被用作探索其他肝保護(hù)藥物的陽(yáng)性對(duì)照[33]。動(dòng)物體內(nèi)的活性氧被抗氧化酶防御，在平衡氧化和抗氧化系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用[34-35]。為了解白首烏花多糖的作用及其抗氧化活性，測(cè)定了小鼠肝臟中MDA和SOD、GSH-Px等抗氧化酶的含量。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的穩(wěn)定代謝物，與生物系統(tǒng)中的自由基效應(yīng)有關(guān)[36]。

白首烏花多糖對(duì)抗氧化酶SOD、GSH-Px、MDA的影響見圖5。

圖5 白首烏花多糖對(duì)抗氧化酶超氧化物歧化酶、谷胱甘肽還原酶和丙二醛的影響Fig.5 Effects of Baishouwu flowers polysaccharide on antioxidant enzymes SOD，GSH-Px，MDA

本文研究表明，與模型組相比，白首烏花多糖處理顯著降低小鼠肝臟MDA水平，提高SOD和GSHPx水平。這表明急性酒精注射可引起嚴(yán)重的氧化應(yīng)激，抗氧化活性可能是白首烏花多糖對(duì)酒精性肝損傷保護(hù)作用的主要機(jī)制。聯(lián)苯雙酯（200 mg/kg）在抑制丙二醛含量的上升方面存在潛在的影響。結(jié)果表明，與模型組相比，400 mg/kg白首烏花多糖組小鼠的SOD和GSH-Px水平分別升高26.64%和60.51%，MDA含量下降33.47%。當(dāng)白首烏花多糖劑量為200 mg/kg時(shí)，SOD和GSH-Px水平分別升高19.967%和36.72%。MDA含量下降23.93%。白首烏花多糖能增強(qiáng)SOD活性和GSH-Px活性，降低MDA含量，說(shuō)明了白首烏花多糖對(duì)緩解酒精誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激具有潛在的作用。

2.7 對(duì)小鼠肝臟IL-1β和TNF-α的影響

炎癥性損傷是酒精性肝損傷的一個(gè)主要特征。已有研究表明，炎癥是機(jī)體對(duì)損傷、應(yīng)激和感染作出的反應(yīng)。腎上腺白質(zhì)退化癥患者可以提高臨床發(fā)生的炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α[37]。臨床研究證明，酒精性肝病患者的IL-1β以及TNF-α含量普遍升高，高濃度則會(huì)導(dǎo)致肝病的嚴(yán)重性和死亡率。

為了研究酒精對(duì)炎癥反應(yīng)的影響，本研究探究了小鼠肝臟IL-1β和TNF-α的水平，見圖6。

與空白組相比，酒精可促進(jìn)小鼠肝勻漿中這些炎癥介質(zhì)水平的升高（p＜0.05）。相比模型組，白首烏花多糖的干預(yù)可以降低肝臟中IL-1β和TNF-α的表達(dá)（p＜0.05），400 mg/kg白首烏花多糖組小鼠的IL-1β以及TNF-α水平分別降低32.56%和27.65%，然而，當(dāng)劑量為200 mg/kg時(shí)，則分別減少了17.77%和23.05%。結(jié)果表明，白首烏花多糖具有降低炎癥水平的作用，可以有效緩解酒精性肝損傷炎癥反應(yīng)。

圖6 白首烏花多糖對(duì)肝臟腫瘤壞死因子α和白介素1β的影響Fig.6 Effects of Baishouwu flowers polysaccharide on inflammatory response TNF- αand IL-1β

3 結(jié)論

綜上所述，白首烏花多糖可以清除體外DPPH自由基，具有一定的體外抗氧化能力。體內(nèi)研究表明，白首烏花多糖對(duì)小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制是降低血清ALT、AST和LDL，增加血清HDL，提高肝臟抗氧化酶的活力，降低肝臟丙二醛脂質(zhì)過(guò)氧化能力，降低肝臟中炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)。以上結(jié)果表明，白首烏花多糖可以作為一種預(yù)防酒精性肝損傷的食療補(bǔ)充劑。