宮頸分泌物中Stat3和Survivin的測定在宮頸病變篩查中的價值

(常熟市第二人民醫(yī)院婦產科，江蘇 常熟 215500)

有85%的宮頸癌發(fā)生在包括中國在內的發(fā)展中國家，從宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)進展到宮頸癌需8～10年時間，在此時間窗內篩查出宮頸癌前病變并進行臨床干預，可以有效預防宮頸癌的發(fā)生。根據(jù)中國子宮頸癌綜合防控指南及中國子宮頸癌篩查及異常管理相關問題專家共識[1]，對中國適齡婦女進行規(guī)范化的細胞學和/或高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，hr-HPV))檢查初篩并進行合理分流可以避免更多女性罹患宮頸癌。但我國細胞學篩查的總體覆蓋率僅21%，經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的基層醫(yī)院細胞病理醫(yī)生和分子實驗醫(yī)生短缺，篩查難以覆蓋。鑒于目前中國的宮頸癌篩查現(xiàn)狀，探索適合經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的篩查方法，提高經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸癌篩查覆蓋率，對減少宮頸癌對經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)女性生殖健康的威脅有著積極意義。本研究旨在探討雙抗體夾心法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 測定宮頸分泌物中信號轉錄與活化因子3(signal transcription and activation factor 3，Stat3)和生存素(Survivin)蛋白含量在宮頸病變篩查中的價值，為經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸病變篩查提供新方法。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年12月至2017年10月常熟市第二人民醫(yī)院婦科門診薄層液基細胞學(thinprep cytologic test，TCT)和/或hr-HPV初篩結果異常行宮頸活檢的192例女性患者為研究對象，納入標準：①已行TCT和/或hr-HPV檢測；②無宮頸癌及癌前病變治療史；③非經(jīng)期取材；④72小時內無性生活、盆浴、陰道檢查、陰道沖洗及局部上藥史。

1.2方法

1.2.1宮頸分泌物標本采集

用新柏氏長柄宮頸刷刷取宮頸管分泌物，充分洗脫至新柏氏細胞保存液中，加組織蛋白萃取劑(裂解液)裂解細胞，4℃ 2 500轉/分鐘離心20分鐘，取上清液，入-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實驗器材與試劑

主要實驗器材為：洗板機、酶標儀、恒溫箱、旋渦混合器。主要實驗試劑為：人Survivin和Stat3 ELISA檢測試劑盒，購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2.3 TCT及hr-HPV檢測

TCT檢查由本院病理科細胞學室副主任醫(yī)師以上的專職醫(yī)生閱片，采用2009年國際癌癥協(xié)會的伯塞斯達系統(tǒng)(the Bethesda system，TBS)對其進行描述性診斷，以無明確診斷意義的不典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undermined significance，ASCUS)以上為細胞學結果異常。采用廣東凱普生物科技股份有限公司的21種(HPV)分型檢測試劑盒(PCR-膜雜交法)進行hr-HPV檢測，14種hr-HPV病毒亞型為16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68，以任意1種及以上hr-HPV陽性為陽性。受醫(yī)保政策和患者主觀因素的影響，行TCT篩查共186例，TCT 結果異常 142例。hr-HPV篩查共154例，陽性132例；ASCUS患者36例全部行hr-HPV檢測進行分流， hr-HPV 陽性26例。TCT+hr-HPV篩查共148例。

1.2.4宮頸活體組織活檢病理檢查

對符合陰道鏡轉診指征的患者行陰道鏡下宮頸多點活檢組織病理學檢查。宮頸活檢組織病理檢查結果為慢性宮頸炎41例，CIN1級56例，CIN2級28例，CIN3級53例，子宮頸原位癌及微小浸潤癌16例(均為鱗癌)。以病理級別最高者作為組織學的最后診斷。

1.2.5 ELISA法檢測Stat3和 Survivin蛋白含量

嚴格按照試劑盒說明對192例患者進行ELISA法Stat3和 Survivin蛋白含量測定。測Survivin和Stat3蛋白濃度分別為0.61～118.07pg/mL和0.037～0.353ng/mL，確定截斷值分別為4.89pg/mL和0.040ng/mL。

1.2.6 結果判定

參照ACOG 2016年10月發(fā)布的子宮頸癌篩查指南[2]，二聯(lián)篩查方案以Survivin、Stat3陽性/TCT ASCUS以上，Survivin、Stat3陰性/TCT LSIL以上，Survivin、Stat3陰性/HR-HPV16、18陽性，Survivin/Stat3雙陽性，Survivin、Stat3陽性/其它12種hr-HPV陽性為陽性結果。三聯(lián)篩查方案以Survivin、Stat3陰性/TCT陰性/HPV16、18陽性，Survivin、Stat3陽性/TCT ASCUS以上 /其它12種hr-HPV陽性，Survivin、Stat3陰性/TCT LSIL以上/HPV陰性或陽性，Survivin和Stat3雙陽性/TCT陰性/hr-HPV陰性或陽性為陽性結果。以宮頸活檢病理結果為診斷金標準，比較Survivin和Stat3單獨及各種聯(lián)合篩查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV用于宮頸病變篩查的效能。

1.3統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。以宮頸活檢病理結果為診斷金標準，病理診斷高度鱗狀上皮內病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSILs) 及以上組(CIN 2級、CIN 3級、子宮頸原位癌及鏡下早期浸潤癌)為陽性組，低度鱗狀上皮內病變(low-grade squamous intraepithelial lesions，LSILs)及以下組(慢性子宮頸炎、CIN1級)為陰性組。計算Survivin和Stat3各單獨和聯(lián)合篩查方案及TCT、hr-HPV和TCT+hr-HPV方案篩查HSILs+的靈敏度、特異度、約登指數(shù)、一致率、陽性預測值與陰性預測值及其95%的可信區(qū)間(95%CI)。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，當理論頻數(shù)<1，n<40，P接近界值0.05時采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 Stat3、Survivin、hr-HPV單獨和聯(lián)合篩查方案效能比較

結果顯示：①單獨篩查方案中，Stat3方案的約登指數(shù)和一致率最高，篩查結果最為真實、可靠。②二聯(lián)篩查方案中，Stat3+hr-HPV方案與Survivin+Stat3方案一致率和約登指數(shù)接近，明顯高于其它二聯(lián)篩查方案，篩查結果比其它二聯(lián)篩查方案真實、可靠。③三聯(lián)篩查方案中，Stat3+TCT+hr-HPV方案的約登指數(shù)和一致率最高，真實性和準確較其它三聯(lián)篩查方案好，見表1。

表1 Stat3、Survivin、hr-HPV單獨及聯(lián)合篩查方案效能比較[%(n/N)]

Table 1 Comparison of efficacy of Stat3 and survivin separate and combined screening with efficacy of TCT,

hr-HPV and TCT+hr-HPV schemes[%(n/N)]

2.2 三種方案的靈敏度和特異度比較

Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的靈敏度和特異度比較顯示，3種方案的總體靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，總體特異度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。χ2分割法檢驗比較，Stat3方案的特異度顯著高于TCT和hr-HPV方案(均P<0.05)，見表2和表3。

表2 Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的靈敏度比較結果(n)

Table 2 Comparison of sensitivity of Stat3, TCT and

hr-HPV(n)

表3 Stat3方案與TCT和hr-HPV方案的特異度比較結果(n)

Table 3 Comparison of specificity of Stat3, TCT and

hr-HPV (n)

注：▲為三種方案的比較，★為Stat3與TCT比較，◆為Stat3與hr-HPV比較。

2.3 四種方案的總體靈敏度和特異度比較

Survivin+Stat3、Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+ hr-HPV方案的靈敏度和特異度比較顯示，4種方案的總體靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，總體特異度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。χ2分割法檢驗比較，Survivin+Stat3方案特異度顯著高于TCT+hr-HPV方案(P<0.05)，Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+hr-HPV方案比較特異度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4和表5。Stat3+hr-HPV和Stat3+TCT+hr-HPV方案與TCT+hr-HPV方案比較約登指數(shù)(0.70/0.71/0.59)和一致率(84.42%/86.46%/79.73%)較好，篩查結果比TCT+hr-HPV方案真實、可靠。但這2種方案與Stat3方案比較， 靈敏度(95.95%/94.67%/92.40%)和特異度(73.75%/76.71%/73.00%)接近，增加了hr-HPV和TCT+hr-HPV檢測費用，不符合衛(wèi)生經(jīng)濟學要求，故兩種方案并不能作為理想的宮頸病變聯(lián)合篩查方案。通過比較、分析，篩選Stat3和Survivin+Stat3方案為單獨和聯(lián)合篩查方案，下面將對Stat3和Survivin+Stat3方案的篩查效能及分流ASCUS的效能進行進一步比較分析。

表44種方案的靈敏度比較結果(n)

Table 4 Comparison of sensitivity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

表54種方案的特異度比較結果(n)

Table 5 Comparison of specificity of survivin+Stat3, Stat3+hr-HPV, Stat3+TCT+hr-HPV and TCT+hr-HPV(n)

篩查方案 篩查結果 陽性陰性合計特異度(%) 95%CI 下限 上限Stat3+hr-HPV21598073.750.732 0.743Survivin+Stat316829883.670.833 0.840Stat3+TCT+hr-HPV 18567476.710.762 0.773TCT+hr-HPV26487464.860.641 0.656χ28.10▲/1.43★/8.08◆/2.07●P0.04▲/0.24★/0.02◆/0.18●

注：▲為4種方案的比較，★為Stat3+hr-HPV與TCT+hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與TCT+hr-HPV比較，●為Stat3+TCT+hr-HPV與TCT+hr-HPV比較。

2.4 Stat3與Survivin+Stat3方案的靈敏度和特異度比較

Stat3與Survivin+Stat3方案靈敏度和特異度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，見表6和表7。

表6 Stat3與Survivin+Stat3方案的靈敏度比較

結果(n)

Table 6 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

篩查方案 篩查結果 陽性陰性合計靈敏度(%) 95%CI 下限 上限Stat38579292.400.922 0.926Survivin+Stat384109489.360.892 0.896χ20.51P0.49

表7 Stat3方案與Survivin+Stat3方案的特異度比較結果(n)

Table 7 Comparison of specificity of Stat3 and survivin+Stat3(n)

篩查方案 篩查結果 陽性陰性合計特異度(%) 95%CI 下限 上限Stat3277310073.000.726 0.735Survivin+Stat316829883.670.833 0.840χ23.32P0.08

2.5 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案在ASCUS分流中的效能比較

3種分流方案的總體靈敏度差異有統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法檢驗，P=0.02)。Stat3方案與hr-HPV方案比較靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(Fisher確切概率法檢驗，P=0.24)，Survivin+Stat3方案的靈敏度顯著低于hr-HPV方案(Fisher確切概率法檢驗，P=0.049)，見表8。

3種分流方案的總體特異度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Stat3與hr-HPV方案比較，特異度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案比較，特異度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表9。

表8 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案

在ASCUS分流中的靈敏度比較結果(n)

Table 8 Comparison of sensitivity of Stat3 and survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲為3種方案的比較，★為Stat3與hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與hr-HPV比較；均為Fisher檢驗。

表9 Stat3和Survivin+Stat3方案與hr-HPV方案在ASCUS分流中的特異度比較結果(n)

Table 9 Comparison of specificity of Stat3 and Survivin+Stat3 and hr-HPV in ASCUS triage(n)

注：▲為3種方案的比較，★為Stat3與hr-HPV比較，◆為Survivin+Stat3與hr-HPV比較。

3討論

3.1 Stat3和Survivin在宮頸癌發(fā)生中的作用

Survivin是一種凋亡抑制基因，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關，本人研究發(fā)現(xiàn)Survivin 與亞洲人口CIN的進展有關[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)Survivin 是hr-HPV持續(xù)感染的分子標記物，對宮頸癌和CIN的診斷有重要價值[4]， Survivin的表達量依賴于HPVE6/E7 的持續(xù)性表達, 沉默HPV E6/E7 基因的表達可使Survivin表達下調[5]。Stat3是一種原癌蛋白，磷酸化的Stat3(phosphorylation of Stat3，p-Stat3)具有生物學功能。Stat3通過控制干細胞的自我更新，造成HPVE6癌蛋白選擇性地過表達，促進子宮頸癌發(fā)生[6]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞株及宮頸癌組織中均存在p-Stat3的表達上調，并伴有下游凋亡抑制基因survivin的表達上調， 用Jak2 特異性抑制劑AG490抑制Stat3活化可造成survivin的表達下調[7]。Shirish等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)Stat3的持續(xù)性活化與HPV陽性宮頸癌的發(fā)生密切相關，抑制 Stat3的表達或活化可使HPV陽性細胞株 E6和 E7 基因表達抑制，宮頸癌細胞株失活。通過以上研究，可以明確Stat3和Survivin在HPV陽性宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起協(xié)同作用，其作用機制為Stat3的持續(xù)性活化導致了hr-HPV的持續(xù)性感染，HPVE6/E7過表達，啟動致癌過程，Survivin表達上調，細胞異常增殖，上皮病變進展為CINⅡ～Ⅲ級，最終導致了子宮頸癌的發(fā)生。這為檢測宮頸脫落細胞中Stat3和Survivin蛋白用于宮頸病變篩查提供了理論依據(jù)。

3.2 Stat3和Survivin在宮頸病變篩查中的價值

ELISA法為最廣泛應用的臨床疾病診斷檢測方法之一，快速、靈敏、簡便、載體易于標準化，實驗技術人員無需特殊培訓，可在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的基層醫(yī)院推廣使用，可從一定程度上彌補經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)基層醫(yī)院細胞病理醫(yī)生缺乏的局限性，并作為臨床宮頸疾病篩查一項重要的輔助檢查。2010年，張?zhí)N霞等研究發(fā)現(xiàn)檢測宮頸分泌物中Survivin蛋白含量用于宮頸癌篩查的靈敏度(85.0%)與TCT(83.3%)比較無差異，特異度(97.8%)明顯高于TCT(76.1%)，認為檢測宮頸分泌物中Survivin含量是一種比較好的宮頸癌輔助診斷方法。王冰玉[10]研究發(fā)現(xiàn)ELISA法測定宮頸分泌物中Survivin蛋白含量聯(lián)合TCT檢查診斷宮頸高級別病變的靈敏度為96.77%，特異度為75.51%，高于TCT和HPV聯(lián)合篩查(93.55%和22.45%)。

本研究結果顯示， Stat3方案的篩查效能高于Survivin，與TCT和hr-HPV方案比較篩查HSILs+的靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，特異度顯著高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，且約登指數(shù)、一致率和陽性預測值均高于TCT和hr-HPV方案(P<0.05)，誤診率和陰道鏡轉診率比TCT降低32.55%和13.21%，比hr-HPV降低47.36%和19.83%。說明 Stat3方案比TCT和hr-HPV方案篩查結果真實、可靠，可以有效降低誤診率，減少不必要的陰道鏡轉診。Stat3方案用于ASCUS分流篩查HSILs+的靈敏度雖低于hr-HPV方案(P>0.05)，但有良好的特異度和陽性預測值，能降低33.33%的誤診率和16.35%的陰道鏡轉診率，比hr-HPV用于ASCUS分流效能更高，有望作為新的ASCUS分流方案。Survivin+Stat3方案與TCT+hr-HPV方案比較，篩查HSILs+的靈敏度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，靈敏度、約登指數(shù)、一致率和陽性預測值高于TCT+hr-HPV方案，篩查結果比TCT+hr-HPV方案真實、可靠，誤診率和陰道鏡轉診率比TCT+hr-HPV方案降低18.90%和11.08%，簡單、經(jīng)濟、易于普及，有望作為新的宮頸病變篩查方案。Survivin+Stat3方案在ASCUS分流中雖特異度高于hr-HPV方案，但靈敏度低(66.67%)，作為ASCUS分流方案漏診率高(33.33%)，故不宜作為ASCUS分流方案。

Stat3單獨篩查方案靈敏度(92.40%)略高于Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案(89.36%)，但特異度(73.00%)、約登指數(shù)(0.65)、一致率(82.29%)和陽性預測值(75.89%)均低于Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案，說明Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案結果比Stat3單獨篩查方案更真實、可靠，效能更高。Stat3單獨篩查方案靈敏度(92.40%)和陰性預測值(91.25%)高，漏診率低，能為篩查結果陰性的患者提供比較可靠的安全篩查間隔，適合用于宮頸病變篩查，Survivin+Stat3聯(lián)合篩查方案特異度(83.76%)和陽性預測值(84.00%)好，誤診率和陰道鏡轉診率低，適合用于宮頸病變診斷。

考慮到我國經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)細胞學篩查和hr-HPV篩查難以覆蓋的現(xiàn)狀、患者的經(jīng)濟承受能力和篩查方案在不同地區(qū)推廣的可行性， 認為Stat3方案適合于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸病變篩查和ASCUS分流， Survivin+Stat3方案適合于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸病變診斷。

如本研究篩查方案能作為宮頸癌篩查策略用于經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)和人群的宮頸病變篩查和診斷，有可能會增加經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸癌篩查覆蓋率，提高經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)的宮頸癌篩查效能，減少誤診和不必要的陰道鏡轉診，有望逐漸減小宮頸癌對發(fā)展中國家女性健康的威脅。