澤瀉與復(fù)方花旗澤仁給藥后澤瀉醇A-24-醋酸酯 在大鼠體內(nèi)的比較藥代動力學(xué)研究

李嘉欣，韓東衛(wèi)，朱蕾，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

花旗澤仁是臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗(IR)的經(jīng)驗(yàn)方。澤瀉為本方主要藥物之一，具有利水、滲濕、泄熱之功。澤瀉醇A-24-醋酸酯為澤瀉的主要活性成分之一，具有明顯的利尿、降血糖、降血脂及抗動脈粥樣硬化、抗脂肪肝、免疫調(diào)節(jié)等功效[1-5]。

本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù)，建立靈敏而可靠的方法檢測花旗澤仁中主要活性成分——澤瀉醇A-24-醋酸酯的血漿藥物濃度，研究正常大鼠灌胃花旗澤仁全方及單味藥澤瀉水煎液后的藥代動力學(xué)過程；比較復(fù)方花旗澤仁及單味藥澤瀉中澤瀉醇A-24-醋酸酯在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)差異。揭示配伍用藥后復(fù)方中其他成分對澤瀉醇A-24-醋酸酯在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)過程的影響，為進(jìn)一步研究花旗澤仁的體內(nèi)代謝和配伍規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品及試劑

西洋參、澤瀉、薏苡仁飲片(黑龍江省世一堂中藥飲片廠)；澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(成都MUST生物技術(shù)有限公司)；地西泮標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 儀器

液相色譜/四級桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；VORTEX-GENIE 2渦旋混合儀(美國Scientific公司)；Centrifuge 5417R低溫高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf AG公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號：SCXK(黑)2013-004。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，明暗周期12 h，房間溫度(20±2)℃，相對濕度50%左右，空氣新鮮，通風(fēng)良好，勤換墊料，自由攝食和飲水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 花旗澤仁水煎液的制備

取花旗澤仁中各藥材，浸泡12 h，第1次加12倍水煎煮，水沸后文火煎煮1 h；第2次加8倍水煎煮，水沸后文火煎煮45 min；第3次加6倍水，水沸后文火煎煮30 min，合并3次水煎液，過濾后水浴濃縮至每毫升含0.54 g生藥藥液，4℃保存，使用前水浴加溫至37℃。

2.2 儲備液的配制

精密稱取地西泮(Diazepam)5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到濃度為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液。精密稱取澤瀉醇A-24-醋酸酯0.4 mg、4 mg、2 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制得濃度分別為40 μg/mL、400 μg/mL、200 μg/mL的儲備液。所有儲備液均置于-20℃保存。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密移取各儲備液適量，以甲醇配成濃度如下的混合工作溶液：0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1、2、4 μg/mL。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品的配制

將上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用空白血漿進(jìn)行1∶20稀釋,得到0.001～0.2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品。

2.5 質(zhì)控(quality control，QC)樣品的配制

QC樣品同法稀釋配制，濃度為0.002、0.02、0.16 μg/mL。

2.6 液相色譜條件

色譜柱為C18柱(1.8 μm，100 mm×3.0 mm，Agilent Technologies，美國)，流速0.3 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣體積10 μL;自動進(jìn)樣器溫度4℃;流動相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈。

澤瀉醇A-24-醋酸酯洗脫方式為梯度洗脫，每個樣品的分析周期為12 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相洗脫程序

2.7 質(zhì)譜檢測條件

采用ESI-離子源，離子源電壓3 500 V、霧化器流速10 L/min、霧化器溫度350℃、干燥氣溫度350℃、干燥氣流速10 L/min、掃描頻率2 amu/s、掃描范圍100～1 300 amu、霧化器壓力50 V、毛細(xì)管電壓3 500 V，質(zhì)譜參數(shù)577.368 1。

2.8 血漿樣品采集

取雄性SD大鼠12只，隨機(jī)分為兩組，即澤瀉組與花旗澤仁組(n=6)，給藥前禁食12 h，自由飲水，分別灌胃給予澤瀉水煎液與花旗澤仁水煎液，劑量為澤瀉組1 mL/100 g，花旗澤仁組1 mL/100 g體質(zhì)量。于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL，肝素抗凝，4 000 rpm離心5 min后取血漿，于-80℃保存,待測。

2.9 血漿樣品處理

移取100 μL血漿樣品，加入500 μL含地西泮(0.1 μg/mL)的甲醇溶液進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋2 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min，移取上清液于30℃氮?dú)饬飨麓蹈桑跉堅(jiān)屑尤爰状?00 μL，渦旋使復(fù)溶，12 000 rpm離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為10 μL。

2.10 方法學(xué)考察

2.10.1 選擇性

取6個空白來源的血漿，加入澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)樣品制成濃度為0.2 μg/mL，并與空白血漿一同處理進(jìn)樣分析，得到色譜圖。通過比較待測組分和內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)峰，判斷空白血漿中的內(nèi)源性成分是否對內(nèi)標(biāo)和待測組分存在干擾。

2.10.2 線性范圍和定量限(LLOQ)

將配制好的6組澤瀉醇A-24-醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品分別按照血漿處理方法進(jìn)樣分析，獲得待測組分與內(nèi)標(biāo)峰面積值。以澤瀉醇A-24-醋酸酯峰面積與內(nèi)標(biāo)物地西泮峰面積作比為縱坐標(biāo)y，以標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品濃度為橫坐標(biāo)x，分別采用1/x加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得到澤瀉醇A-24-醋酸酯待測組分血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性回歸系數(shù)R2。

LLOQ為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，其響應(yīng)值應(yīng)滿足響應(yīng)信噪比為1∶10，且精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation，RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為相對偏差(Relative error，RE)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

2.10.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，測得待測成分與內(nèi)標(biāo)峰面積A3。將不同個體的空白血漿樣品(n=6)按照血漿樣品處理方法操作后，加入與QC樣品同等濃度的澤瀉醇A-24-醋酸酯與內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析測得峰面積A2。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到峰面積A1。

基質(zhì)效應(yīng)為A2/A1；提取回收率為A3/A2，精密度RSD應(yīng)≤20%。

2.10.4 精密度和準(zhǔn)確度

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，于同天進(jìn)行6次測定，得到3種待測組分及內(nèi)標(biāo)峰面積值，分別帶入回歸方程計(jì)算濃度值，求算日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度。連續(xù)3天進(jìn)樣分析，共得到18個濃度值，求算日間精密度和準(zhǔn)確度。

精密度表示為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為相對偏差(RE)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。

2.10.5 樣品穩(wěn)定性

將配制好的QC樣品分別做如下處理：1)反復(fù)凍融3次后按照血漿樣品處理方法操作后進(jìn)樣分析；2)于室溫下25℃放置4 h后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；3)置于-80℃冷凍2周后取出解凍后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；4)按照血漿樣品處理方法操作后置于自動進(jìn)樣器(4℃)12 h后進(jìn)樣分析。將上述測得峰面積值帶入回歸方程求算血藥濃度。

2.11 藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)處理

采用DAS2.0數(shù)據(jù)處理軟件的非房室模型法(統(tǒng)計(jì)矩法)進(jìn)行藥代動力學(xué)參數(shù)Tmax、Cmax、AUC0-t、t1/2、MRT0-t及CL等參數(shù)的計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 選擇性

圖1表明，在待測組分和內(nèi)標(biāo)的出峰位置，空白血漿中的其他內(nèi)源性成分不造成干擾。在上述分析條件下，澤瀉醇A-24-醋酸酯的保留時(shí)間為9.39 min，地西泮1. 67 min。

圖1 地西泮(1)、澤瀉醇A-24-醋酸酯(2) 血漿樣品色譜圖注：A為空白血漿；B為空白血漿標(biāo)準(zhǔn)添加LLOQ的待測組分和內(nèi)標(biāo)；C為給藥2 h后的實(shí)測血漿樣品

3.1.2 線性范圍與定量限

標(biāo)準(zhǔn)曲線在考察的下列濃度范圍內(nèi)顯示良好的線性關(guān)系，澤瀉醇A-24-醋酸酯：0.001～0.2 μg/mL。待測組分的平均回歸方程見表2。

將不同個體空白血漿新配LLOQ濃度點(diǎn)樣品并按照血漿處理方法進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，信噪比(S/N)為1∶10，精密度RSD<20%，準(zhǔn)確度RE在±20%范圍內(nèi)。LLOQ點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度符合生物樣品分析要求，所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

3.1.3 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

表3列出了低、中、高QC濃度的澤瀉醇A-24-醋酸酯和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率考察結(jié)果。在低、中、高濃度下，澤瀉醇A-24-醋酸酯存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，但在85%～115%范圍內(nèi)，精密度RSD<20%，不影響本分析方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，符合生物樣品分析要求。提取回收率結(jié)果顯示在血漿樣品前處理?xiàng)l件下，蛋白沉淀法對澤瀉醇A-24-醋酸酯的提取回收率>80%，因此血漿處理方法對澤瀉醇A-24-醋酸酯的提取回收率良好。

表2 待測組分的平均回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍與LLOQ(n=6)

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

表3 待測組分在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=6)

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯；Diazepam：地西泮

3.1.4 精密度和準(zhǔn)確度

如表4所示，澤瀉醇A-24-醋酸酯日內(nèi)精密度(RSD)為4.0%～9.8%，日間精密度(RSD)為5.7%～8.1%，日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度(RE)分別為1.6%～6.7%與-2.1%～4.6%；數(shù)據(jù)表明待測組分在大鼠的血漿中準(zhǔn)確度和精密度均符合分析要求。

表4 待測組分在大鼠血漿中的精密度和準(zhǔn)確度

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

3.1.5 樣品穩(wěn)定性

表5 待測組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性

注：Alisol A 24-acetate：澤瀉醇A-24-醋酸酯

如見表5所示，低、中、高3個QC濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.8%～9.5%，相對偏差RE為-5.4%～7.6%；室溫下25 ℃放置4 h的短期穩(wěn)定性考察結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.0%～13.9%，相對偏差RE為-4.6%～4.9%；-80℃冷凍條件下保存2周的長期穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.3%～9.1%，相對偏差RE為-8.7%～5.1%；以及樣品處理后置于自動機(jī)進(jìn)樣器(4℃)中12 h的穩(wěn)定性結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為11.1%～13.8%，相對偏差RE為-2.4%～9.3%，RSD結(jié)果均小于20%，RE均在±20%范圍內(nèi)，表明待測組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性符合生物樣品的分析要求。

3.2 藥代動力學(xué)結(jié)果

對兩組共12只SD大鼠一次分別灌胃澤瀉與花旗澤仁水煎液后，于系列時(shí)間點(diǎn)取血漿，并采用上述血漿樣品前處理方法操作后進(jìn)行進(jìn)樣分析，所測平均血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)見表6。主要藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果見表7，其平均血藥濃度-時(shí)間曲線如圖2。結(jié)果表明，花旗澤仁組與澤瀉組相比，藥時(shí)曲線下面積顯著增加，且依然成雙峰現(xiàn)象，清除率顯著降低，Cmax、Tmax、t1/2、MRT0-t均無顯著性差異。

表6 大鼠口服不同水煎液后澤瀉醇A-24-醋酸酯的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)

注：n.d.：未檢出，低于定量下限

表7 大鼠口服不同水煎液后澤瀉醇A-24-醋酸酯的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

注：與澤瀉組比較，*P<0.05

圖2 大鼠口服不同提取物后澤瀉醇A-24-醋酸酯 的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

4 討論

本實(shí)驗(yàn)樣品前處理選擇蛋白沉淀(PP)法，以甲醇作為沉淀劑，沉淀蛋白后以氮?dú)獯蹈蓾饪s進(jìn)樣分析。為提高實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)對血漿樣品前處理方法進(jìn)行篩選與優(yōu)化，考察3、4、5、6、7倍體積甲醇沉淀血漿蛋白后的質(zhì)譜響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)5倍體積的甲醇處理，能將澤瀉醇A-24-醋酸酯提取較為完全而稀釋較少，從而獲得最大的質(zhì)譜響應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，配伍后澤瀉的活性成分澤瀉醇A-24-醋酸酯的平均藥時(shí)曲線依然呈現(xiàn)明顯的雙峰現(xiàn)象，如圖2所示，達(dá)峰時(shí)間為1 h，但在6 h有明顯的濃度峰值，此前也有研究報(bào)道此雙峰現(xiàn)象的存在[6]。對于此現(xiàn)象的原因，可能是由于澤瀉醇A-24-醋酸酯經(jīng)腸道吸收進(jìn)入肝臟之后，通過膽汁排泄，隨膽汁到達(dá)小腸后被重吸收，即通過“肝腸循環(huán)”而產(chǎn)生。藥物吸收存在諸多因素的干擾，藥物性質(zhì)、生理學(xué)等方面的因素都可能造成不規(guī)則的藥物吸收現(xiàn)象的發(fā)生，例如肝腸循環(huán)、胃排空、胃腸蠕動及藥物相互作用等[7]。

比較配伍前后的藥動學(xué)參數(shù)，在澤瀉單獨(dú)給藥組中，澤瀉醇A-24-醋酸酯于30 min血藥濃度就迅速達(dá)峰，然而在花旗澤仁組中其達(dá)峰時(shí)間延長至1 h出現(xiàn)第一個峰值，藥時(shí)曲線上吸收相明顯延長，表明配伍后可明顯改變其在大鼠體內(nèi)的吸收行為。花旗澤仁組澤瀉醇A-24-醋酸酯藥時(shí)曲線下面積明顯增加，清除率CL比澤瀉組顯著降低，表明配伍可提高澤瀉醇A-24-醋酸酯在體內(nèi)的吸收程度，并減慢其清除率，延長澤瀉醇A-24-醋酸酯在體內(nèi)的作用時(shí)間，從而增強(qiáng)澤瀉醇A-24-醋酸酯降血脂[8]及其對胰島細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[9]。配伍用藥后，可能會間接影響胃腸蠕動和胃排空的速率，胃腸道蠕動的變化容易造成藥物吸收入血的差異，這可能是澤瀉醇A-24-醋酸酯AUC0-t明顯增加的機(jī)制之一。此外，由于中藥繁多的化學(xué)成分，可能是細(xì)胞色素P450(CYP/P450)的底物、抑制劑，或抑制作用占主導(dǎo)地位，從而對相互之間的藥代動力學(xué)過程產(chǎn)生影響。

本實(shí)驗(yàn)通過探討澤瀉配伍為花旗澤仁對澤瀉醇A-24-醋酸酯藥代動力學(xué)行為的影響，從藥代動力學(xué)角度闡明花旗澤仁成藥性特征，為指導(dǎo)花旗澤仁臨床合理用藥提供參考，為獲得治療2型糖尿病胰島素抵抗的候選新藥奠定基礎(chǔ)。