基于脊髓 NLRP1-Caspase-1-IL-1β通路探討電針治療神經(jīng)病理性疼痛的作用機(jī)制*

王志福 楊意州 劉建波 李長征 龔德貴 俞向梅△

(1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福州350003)

神經(jīng)病理性疼痛常見于各種疾患中，治療遷延反復(fù)。各種藥物的治療，仍存在一定的不良反應(yīng)，電針治療神經(jīng)病理性疼痛具有安全、簡便而無副作用的優(yōu)點(diǎn)，臨床及基礎(chǔ)研究已證實電針鎮(zhèn)痛的有效性，而其機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究[1,2]。白介素-1β(Interleukin-1 beta, IL-1β) 作為重要的促炎細(xì)胞因子之一，在神經(jīng)性病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中起重要作用[3]。

核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 (nod-like receptor proteins, NLRP) 炎性體，是一類由NLRP蛋白家族成員、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)和 接 頭 蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing caspase-activating recruitment domain, ASC) 組成的蛋白復(fù)合物，已知其主要功能是參與IL-1β的成熟過程[4,5]。NLRP1是人類NLRP家族中最早發(fā)現(xiàn)的一個成員，基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，NLRP1可識別和感知體內(nèi)外各種傷害性信號，與各種疼痛（如復(fù)雜性區(qū)域疼痛綜合征、佐劑關(guān)節(jié)炎、慢性盆腔疼痛綜合征等）發(fā)生密切相關(guān)，表現(xiàn)為外周組織及脊髓內(nèi)NLRP1、caspase-1、IL-1β等活化增加。炎癥小體中，NLRP1及其產(chǎn)物caspase-1是IL-1β成熟的重要上游通路，激活的NLRP1參與疼痛敏化的形成過程[6～9]。外周神經(jīng)損傷時，脊髓IL-1β 轉(zhuǎn)錄表達(dá)大量IL-1β前體分子，被重要蛋白酶caspase-1剪切為成熟IL-1β，從而發(fā)揮生物學(xué)活性[10]。

本項目組前期實驗研究證實，在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時，脊髓內(nèi)大量IL-1β成熟釋放，與NLRP1及caspase-1活化密切相關(guān)；電針環(huán)跳、陽陵泉對神經(jīng)病理性疼痛具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可減少脊髓內(nèi)IL-1β的產(chǎn)生[6,11,12]。而電針是否可通過調(diào)節(jié)脊髓NLRP1及caspase-1活性，從而降低脊髓IL-1β釋放，以發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用，是本研究關(guān)注的主要問題。

方 法

1.實驗動物

SPF 級雄性 Sprague-Dawley大鼠42只，體重200～220 g，由上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司提供，生產(chǎn)許可證號 SCXK（滬）2012-0002。在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，許可證號SYXK（閩）2013-009。將大鼠稱重并編號。所有實驗均遵照國際動物保護(hù)和使用指南的規(guī)定實施。

2.試劑與儀器

使用4-0鉻制羊腸線（上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司）。華佗牌一次性針灸針 (0.28 mm×15 mm)、電針治療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。Belnacasan,VX-765 （貨號：S2228，50 mg粉末裝），美國Selleck生物科技有限公司；胞壁酰二肽(Muramyl Dipeptide，MDP，貨號：A9519，規(guī)格：5 mg)， 美 國 Sigma公 司。NLRP1、Caspase-1，GAPDH引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IQ5多重實時熒光定量 PCR儀器，美國Bio-Rad公司。38450 -電子觸覺測量儀（電子Von Frey），意大利Ugo Basile公司；輻射熱測痛儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

3.實驗分組及模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組(CCI)、假手術(shù)組(Sham-operation)、電針組(Electro-acupuncture, EA)、非電針組 (Sham-EA)、DMSO組、VX-765(Caspase1抑制劑)組、MDP （NLRP1激活劑）組，每組各6只。模型組建立坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷 (chronic constriction injury, CCI) 神經(jīng)病理性疼痛模型，不干預(yù)；假手術(shù)組只切開皮膚，不結(jié)扎坐骨神經(jīng)；電針組造模成功第7天后(P7)，選取“環(huán)跳”、“陽陵泉”穴電針，每日1次，持續(xù)干預(yù)至P14；非電針組大鼠只進(jìn)行針刺如上穴位，不接通電針治療儀；DMSO組造模成功第7天后(P7)，脊髓鞘內(nèi)注射8% DMSO 3次，每次注射20 μl；VX-765（Caspase-1抑制劑）組分別在P7、P10、P14脊髓鞘內(nèi)注射VX-765（溶解于8% DMSO，2 mg/kg注射）各1次；MDP組分別在P7、P10、P14脊髓鞘內(nèi)注射MDP（溶解于8%DMSO，0.1 mg/kg注射）各1次。坐骨神經(jīng)慢性限制性損傷 (chronic constriction injury,CCI)神經(jīng)病理性疼痛模型制備過程如下：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉 (4 ml/kg) 后，右側(cè)后肢皮膚切開，肌肉鈍性分離，暴露坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)中段用4-0鉻制羊腸線松扎四道，致慢性CCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，術(shù)后在傷口處撒適量青霉素粉末預(yù)防感染。模型建立后，術(shù)后第7日 (P7)和第14日 (P14) 觀察實驗大鼠機(jī)械痛、熱痛行為學(xué)變化。

4.電針干預(yù)方法

電針穴位參照大鼠穴位圖譜（華興邦, 周浩良.大鼠穴位圖譜的研制.實驗動物與動物實驗,1991），結(jié)合本課題以往研究經(jīng)驗[12]，擬取手術(shù)患側(cè) (右側(cè)) 肢體的“環(huán)跳”(GB30) 與“陽陵泉”(GB34)穴，給予“疏密波”（2 Hz/100 Hz 交替；強(qiáng)度≤1 mA；時間 30 min）電針治療。安靜環(huán)境中，室溫20±2℃，將大鼠軀干固定于木架上，頭部與四肢可自由活動，靜置 20 min后，將 0.25寸一次性針灸針刺入大鼠右側(cè)“環(huán)跳”與“陽陵泉”穴，通過G6805-1A型多功能電針治療儀給予“疏密波”刺激，強(qiáng)度以引起大鼠后肢肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜 (≤ 1 mA)。

5.脊髓鞘內(nèi)注射方法

大鼠取俯臥位，實驗者食指定位于大鼠脊柱L5-6間隙，右手持微量注射器從間隙垂直緩慢進(jìn)針，以大鼠尾巴出現(xiàn)顫動或突然的側(cè)向甩動作為穿刺成功的標(biāo)志，注入相應(yīng)的工具藥 (VX-765、MDP) 或等劑量 DMSO 緩沖液 20 μl。

6.觀測指標(biāo)

（1）機(jī)械痛行為測試

測試環(huán)境為10 cm × 20 cm × 20 cm有機(jī)玻璃籠，將大鼠放入籠內(nèi)靜置10 min后，采用Ugo Basile原創(chuàng)設(shè)計的電子觸覺測量儀(e-VF)，自動記錄大鼠的受刺激強(qiáng)度（即大鼠的縮爪反應(yīng)閾值），以此反應(yīng)大鼠的機(jī)械痛敏情況。

（2）熱痛行為測試

安靜環(huán)境中，室溫 20±2℃，將大鼠放入測痛儀上方的玻璃格子中，自由活動。大鼠靜置20 min后，采用336型輻射熱測痛儀強(qiáng)光照射大鼠足掌，測定大鼠的縮爪潛伏期 (paw withdrawal latency, PWL)。測定時每次間隔不低于l min，大鼠 PWL 基本穩(wěn)定后取后3次測定結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)值 (baseline)。測定時熱源強(qiáng)度維持在恒定水平，使基礎(chǔ)痛閾控制在8～12 s左右。為防止大鼠熱輻射燙傷，將PWL的上限值 (cut-off time) 定為20 s。

（3）脊髓IL-1β、NLRP1、Caspase-1檢測

全部實驗結(jié)束后 (P14)，迅速新鮮取材脊髓 （L4-5節(jié)段）背角置于液氮中，最后儲存于-80℃保存待測。ELISA法檢測脊髓成熟蛋白IL-1β表達(dá)變化，real time-PCR檢測脊髓NLRP1、caspase-1 mRNA表達(dá)變化。

7.統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤 ()表示。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗中獨(dú)立樣本比較。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.神經(jīng)病理性疼痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為學(xué)變化

與假手術(shù)組相比，模型組 (CCI) 大鼠從造模后第7天、第14天，機(jī)械痛、熱痛閾值均顯著降低 (P＜ 0.01)；與模型組相比，多次電針可顯著提高CCI大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值 (P＜ 0.01)，非電針并未改變痛行為學(xué)變化（見圖1A, 1B）。

與模型組相比，多次脊髓鞘內(nèi)注射VX-765則可明顯提高大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值(P＜ 0.01)，而多次脊髓鞘內(nèi)注射MDP卻可進(jìn)一步降低大鼠機(jī)械痛、熱痛閾值 (P＜ 0.01、P＜ 0.05，見圖 2A, 2B)。

2.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)變化的影響

在造模后第14天，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)顯著增加(P＜ 0.01)；與模型組相比，多次電針可顯著降低脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P＜ 0.01)，鞘內(nèi)注射caspase-1抑制劑 (VX-765)可顯著抑制脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P＜ 0.01)；相反，鞘內(nèi)注射NLRP1激活劑 (MDP)則進(jìn)一步上調(diào)脊髓背角NLRP1、Caspase-1mRNA的表達(dá) (P＜ 0.01，見圖 3A, 3B)。

3.神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓IL-1β表達(dá)變化的影響

在造模后第14天，脊髓ELISA檢測方法結(jié)果提示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓背角成熟蛋白IL-1β的表達(dá)顯著增加 (P＜ 0.01)；與模型組相比，多次電針可顯著降低脊髓背角IL-1β蛋白的表達(dá) (P＜ 0.01)，脊髓鞘內(nèi)注射caspase-1抑制劑 (VX-765)可顯著抑制脊髓成熟蛋白IL-1β的表達(dá) (P＜0.01)；相反，鞘內(nèi)注射NLRP1激活劑 (MDP) 則進(jìn)一步上調(diào)脊髓IL-1β的表達(dá) (P＜ 0.01，見圖4)。

討 論

神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損害或疾病導(dǎo)致的疼痛；神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生時，脊髓中樞內(nèi)出現(xiàn)顯著的神經(jīng)炎癥，抑制脊髓中樞炎癥可減輕痛敏反應(yīng)[13,14]。經(jīng)典CCI神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型，在一定程度上模擬臨床干性坐骨神經(jīng)病理性疼痛特點(diǎn)。本課題組前期研究證實，電針“環(huán)跳”、“陽陵泉”穴對神經(jīng)病理性疼痛大鼠具有顯著鎮(zhèn)痛作用[12,15]，臨床應(yīng)用二穴電針治療坐骨神經(jīng)病理性疼痛，療效明確，其脊髓中樞機(jī)制有待進(jìn)一步明確[16,17]。

圖1 電針對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為變化的影響(n = 6,EM)Fig.1 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with Electroacupuncture intervention (n = 6,EM)

圖2 NLRP1Caspase-1對神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛、熱痛行為變化的影響(n = 6,EM)Fig.2 Changes of the paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency with NLRP1Caspase-1 pathway regulation (n = 6,EM)

圖3 電針對神經(jīng)痛大鼠脊髓NLRP1、Caspase-1mRNA表達(dá)變化的影響(n = 4,EM)Fig.3 Changes of the spinal expression of NLRP1 and Caspase-1 mRNA with Electroacupuncture intervention(n = 4,EM)

圖4 電針對神經(jīng)痛大鼠脊髓IL-1β表達(dá)變化的影響(n = 4,EM)Fig.4 Changes of the spinal expression of IL-1β protein with Electroacupuncture intervention (n = 4,EM)

坐骨神經(jīng)病理性疼痛屬中醫(yī)學(xué)痹癥的范疇，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析，環(huán)跳、陽陵泉穴深層解剖 為坐骨神經(jīng)及其分支；針刺刺激穴位鄰近神經(jīng)及其周圍血管，可促進(jìn)局部血液循環(huán)，改善局部炎癥和滲出，緩解神經(jīng)病理性疼痛癥狀[18]。

本課題組前期研究表明，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生及發(fā)展中，脊髓膠質(zhì)細(xì)胞活化可釋放促炎癥因子(IL-1β、IL-6等)，維持脊髓中樞敏化和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓中，NLRP-l炎癥小體被顯著激活，激活的NLRP-l及caspase-1主要表達(dá)于脊髓背角淺層星形膠質(zhì)細(xì)胞中[6,11,19]。當(dāng)受到外來刺激時，激活的炎癥小體NLRP-l可水解其組成結(jié)構(gòu)中的pro-caspase-1分子使其成為成熟caspase-1，成熟caspase-1大量釋放并剪切IL-1β前體分子變成為成熟IL-1β，參與炎癥反應(yīng)過程[20]。結(jié)合既往文獻(xiàn)報道及前期研究，本實驗說明，神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中，脊髓內(nèi)炎癥小體NLRP-l和caspase-1激活，促進(jìn)脊髓IL-1β成熟釋放，維持中樞敏化和神經(jīng)炎癥，表現(xiàn)機(jī)械痛和熱痛過敏反應(yīng)。應(yīng)用電針或caspase-1抑制劑可降低脊髓IL-1β表達(dá)水平，提高神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛閾值，從而發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛作用；然而，經(jīng)典NLRP-l激活物（胞壁酰二肽，MDP）鞘內(nèi)注射可顯著激活NLRP-l-caspase-1-IL-1β信號通路，促進(jìn)脊髓IL-1β釋放增多，進(jìn)一步誘發(fā)痛敏反應(yīng)。

綜上所述，神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展與脊髓背角NLRP-l-caspase-1-IL-1β信號通路活化存在密切的聯(lián)系，電針抗炎鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與抑制脊髓NLRP-l-caspase-1-IL-1β通路活化有關(guān)，今后可應(yīng)用NLRP-l、IL-1β、Caspase-1等基因敲除小鼠深入開展實驗，進(jìn)一步明確電針抗炎鎮(zhèn)痛的脊髓中樞IL-β調(diào)節(jié)機(jī)制。