武夷山脈金線蓮組培技術(shù)研究

摘 要：以武夷山脈金線蓮的嫩莖段作為外植體，研究其組培快繁技術(shù)體系，結(jié)果表明：10%次氯酸鈣溶液消毒15min對(duì)外植體消毒處理效果最佳，存活率達(dá)70.0%；嫩莖段在MS+ KT 0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培養(yǎng)基下進(jìn)行增殖培養(yǎng)效果最佳，增殖系數(shù)達(dá)3.40；培養(yǎng)基中添加100g·L-1馬鈴薯泥有利于促進(jìn)芽苗的健壯生長(zhǎng)與生根培養(yǎng)。生根苗經(jīng)過精心培育，成活率達(dá)95%以上。

關(guān)鍵詞：金線蓮；嫩莖段；組培技術(shù)

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）12-0074-3

金線蓮別名金線蘭、金絲草，為蘭科開唇植物花葉蘭屬多年生珍稀中草藥，使用范圍廣泛，素有“藥王”、“金不換”、“烏人參”等美稱。由于金線蓮對(duì)生長(zhǎng)條件要求苛刻，自然繁殖率低，生長(zhǎng)緩慢，加上人為過度采挖，致使野生資源瀕臨絕種。福建省武夷山屬亞熱帶海洋性濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，夏無酷暑，冬無嚴(yán)寒，雨量充沛，光熱充足，相對(duì)濕度較大。得天獨(dú)厚的地理、氣候、水文條件及森林效應(yīng)，形成了特殊的生態(tài)條件，為金線蓮生長(zhǎng)創(chuàng)造了理想的生態(tài)環(huán)境，境內(nèi)金線蓮種質(zhì)資源豐富，藥用價(jià)值高。近年來，南平市規(guī)劃創(chuàng)建武夷新區(qū)生物產(chǎn)業(yè)核心區(qū)，同時(shí)也在積極建立天然藥物藥材良種繁育示范基地，以地道藥材為基礎(chǔ)，建設(shè)地道植物藥材培育示范基地，逐步建成集原料引種試驗(yàn)、良種繁育、示范、觀光于一體的示范帶動(dòng)區(qū)域。優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)資源是發(fā)展生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的先決條件，為此筆者以武夷山境內(nèi)經(jīng)過良種選育出來的野生金線蓮種苗作為試驗(yàn)對(duì)象開展組培技術(shù)的研究，為武夷山脈金線蓮道地藥材的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料取自福建省武夷山境內(nèi)，以經(jīng)過選優(yōu)的野生金線蓮種苗作為外植體。

1.2 培養(yǎng)基配制和培養(yǎng)條件 以MS作為基本培養(yǎng)基，根據(jù)需要添加不同濃度的KT、NAA、IBA等植物激素，并附以瓊脂0.6%、蔗糖3%，調(diào)整pH值為5.6～5.8，煮沸，待瓊脂融化后分裝到組培瓶中，在121℃下高壓滅菌18～20min，取出冷卻凝固后待用。將培養(yǎng)苗置于光照培養(yǎng)架下培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度設(shè)置在23～27℃，光照強(qiáng)度1500～2000lx，光照時(shí)數(shù)12h·d-1。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 材料的表面滅菌 將取回的野生金線蓮種苗剪去葉片后用自來水沖洗干凈。接著拿到接種室超凈工作臺(tái)上用75%酒精浸泡外植體20s，無菌水沖洗1次后再進(jìn)行消毒處理對(duì)比試驗(yàn)。把消毒好的外植體剪切成帶芽的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，30d后統(tǒng)計(jì)比較消毒效果，篩選出最佳的外植體消毒方法。消毒試驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)處理（10%次氯酸鈣溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min、10%次氯酸鈣溶液消毒15min、0.1%HgCl2消毒10min）。

1.3.2 芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng) 本試驗(yàn)選擇在MS基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，外加不同濃度水平的KT和IBA激素，按正交設(shè)計(jì)組成9個(gè)處理，每個(gè)處理接種50個(gè)莖段，重復(fù)3次，40d后統(tǒng)計(jì)芽分化數(shù)及分化情況。

1.3.3 壯苗與生根培養(yǎng) 將誘導(dǎo)出的芽苗接種到添加不同濃度馬鈴薯泥的培養(yǎng)基中，研究不同濃度馬鈴薯泥對(duì)金線蓮壯苗與生根培養(yǎng)的影響。各試驗(yàn)不同處理、水平代號(hào)見表1～表3所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體誘導(dǎo)存活的影響 外植體在接種之前，必須經(jīng)過嚴(yán)格地消毒滅菌，特別是野外采集回來的外植體，因在自然環(huán)境下生長(zhǎng)帶菌量大，增加消毒的難度。外植體消毒的基本原則是既要徹底地殺滅各種有害菌，又不致于過度損傷組織材料，而影響生長(zhǎng)。由表4可知，3種不同消毒處理中，以10%次氯酸鈣溶液消毒15min效果好，外植體存活率高，達(dá)70%，10%次氯酸鈣溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min效果次之，達(dá)53.3%，單純用0.1%HgCl2消毒10min效果最差，外植體存活率僅為30%。這可能是因?yàn)橐吧鹁€蓮莖段組織幼嫩，細(xì)胞壁薄，而HgCl2溶液較次氯酸鈣具有較強(qiáng)的細(xì)胞滲透能力，過長(zhǎng)消毒時(shí)間對(duì)組織細(xì)胞具有明顯的毒害作用，影響外植體存活。因此，武夷山脈金線蓮?fù)庵搀w消毒處理應(yīng)以10%次氯酸鈣溶液消毒為主，時(shí)間以15min為宜。

2.2 芽誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng) 金線蓮增殖快繁技術(shù)可以通過原球莖增殖和芽苗增殖2種方式進(jìn)行，采用芽苗增殖方式可以保持原種的優(yōu)良特性，為良種快繁最主要采用的方式。通過芽苗增殖方式除了選擇正確的培養(yǎng)基和適宜的培養(yǎng)環(huán)境外，最主要的影響還在于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類和配比濃度。我國植物生理學(xué)家發(fā)現(xiàn)適宜的細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度比，可以有效地控制植物組織培養(yǎng)過程中芽和根的發(fā)生。

由表5可知，培養(yǎng)基中添加KT與IBA激素組合可以有效促進(jìn)金線蓮芽苗增殖。不同濃度激素組合對(duì)金線蓮芽苗的誘導(dǎo)與增殖影響較大，芽苗的分化系數(shù)變動(dòng)范圍為1.72～3.40。本試驗(yàn)中，以中濃度的KT與中高濃度的IBA配合促進(jìn)芽的增殖效果最明顯，芽苗分化系數(shù)可達(dá)3.0以上。高濃度的KT對(duì)金線蓮芽的誘導(dǎo)有明顯的抑制作用，生長(zhǎng)素IBA對(duì)芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。在試驗(yàn)使用的KT與IBA激素組合中，以KT0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1組合效果最佳，分化系數(shù)達(dá)3.40，這對(duì)于武夷山脈金線蓮組培快繁生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2.3 壯苗與生根培養(yǎng) 蘭科類植物在組織培養(yǎng)過程中需要添加一定量的馬鈴薯泥、香蕉泥或椰子汁，可有利于促進(jìn)培育健壯的植株。在本試驗(yàn)中，通過培養(yǎng)基中添加一定濃度的馬鈴薯泥（先煮熟再用攪拌機(jī)攪成糊狀），研究不同濃度的馬鈴薯泥對(duì)芽苗增壯和生根培養(yǎng)的影響。從表6分析得知，培養(yǎng)基中添加一定濃度的馬鈴薯泥對(duì)金線蓮植株的生長(zhǎng)與生根培養(yǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。當(dāng)每升培養(yǎng)基中添加100g·L-1的馬鈴薯泥時(shí)，金線蓮芽苗莖桿粗壯，葉色深綠，芽苗健壯，根數(shù)可達(dá)3～5條，基本符合馴化移栽的要求，過多或過少均不利于壯苗與生根培養(yǎng)。

2.4 煉苗與移栽 當(dāng)金線蓮瓶苗根系長(zhǎng)至1.5～2.5cm左右時(shí)，應(yīng)將生根瓶苗搬到馴化室進(jìn)行自然環(huán)境中煉苗培養(yǎng)。經(jīng)過約30～50d左右的煉苗培養(yǎng)后，當(dāng)芽苗莖桿顏色轉(zhuǎn)為褐色，葉片肥厚時(shí)，打開瓶蓋，再煉苗1～2d，然后小心取出，洗凈根部附著的培養(yǎng)基，移植于經(jīng)過消毒處理的混合基質(zhì)中。種植前7d，用0.1%高錳酸鉀溶液對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒。金線蓮性喜陰涼、潮濕、通風(fēng)的環(huán)境，基質(zhì)要求疏松通氣。移栽基質(zhì)應(yīng)以腐殖土為主，外加一定量的珍珠巖，移栽后應(yīng)嚴(yán)格控制澆水量，只要保持基質(zhì)濕潤(rùn)即可。晴天應(yīng)加蓋2層遮陽網(wǎng)，以減少陽光直射，避免灼傷。7d后，可噴多菌靈800倍或托布津1000～1200倍溶液殺菌。經(jīng)過30d精心培育，小苗平均成活率達(dá)95%以上。

3 結(jié)論與討論

（1）外植體滅菌處理應(yīng)選擇合適的消毒劑和消毒方法，既要保證外植體能徹底滅菌，又不至于過度地傷害外植體細(xì)胞。武夷山脈金線蓮的嫩莖在10%次氯酸鈣溶液消毒15min處理下，外植體存活率最高，達(dá)70.0%。

（2）武夷山脈金線蓮嫩莖誘導(dǎo)與增殖培養(yǎng)基以KT 0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1組合效果最佳，分化系數(shù)達(dá)3.40，這對(duì)于武夷山脈金線蓮組培快繁生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

（3）在壯苗與生根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中添加100g·L-1馬鈴薯泥有利于促進(jìn)芽苗的健壯生長(zhǎng)，培育壯苗。

（4）金線蓮性喜陰涼潮濕通風(fēng)環(huán)境，在移栽管理過程中，應(yīng)嚴(yán)格控制澆水量，保持基質(zhì)濕潤(rùn)即可，同時(shí)注意做好通風(fēng)降溫遮光處理，經(jīng)過40d的精心培育，平均成活率可達(dá)95%以上。

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（責(zé)編：張宏民）