生物納米孔分析技術(shù)研究進(jìn)展

任明偉

摘 要 本文從生物納米孔的%Z-HL納米孔、Aerolysin納米孔、MspA納米孔、噬菌體phi29連接器的四種分類出發(fā)，對生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展進(jìn)行了分析，納米孔分析技術(shù)的發(fā)展，特別是近年來在DNA測序得到了廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 生物納米孔 DNA測序

中圖分類號：Q819 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

0前言

納米孔技術(shù)作為低成本、高效率的DNA檢測技術(shù)，研究已經(jīng)取得了巨大進(jìn)步。本文著重介紹分子生物學(xué)技術(shù)的組合，以及納米孔技術(shù)的新進(jìn)展。

1生物納米孔的種類

1.1 %Z-HL納米孔

%Z-HL生物通道蛋白被用于構(gòu)建了第一個納米孔，也是目前應(yīng)用最為廣泛的生物納米孔。%Z-HL是金黃色葡萄球菌分泌的一種多肽毒素，含有293個氨基酸，相對分子質(zhì)量為3.32？04，可通過自組裝形成七聚體的跨膜通道，這一蘑菇狀的納米通道由一個較大的膜外前庭和一個%[-桶狀結(jié)構(gòu)的跨膜莖部組成。%Z-HL優(yōu)異的性質(zhì)使其成為目前應(yīng)用最為廣泛的生物納米通道：首先，%Z-HL易于自組裝和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，電導(dǎo)均勻，使得分析物產(chǎn)生的阻斷事件可重復(fù)；第二，%Z-HL對分析物本質(zhì)上是非選擇性的，確保電流阻斷事件是由要測量的各個分子的體積效應(yīng)引起的。第三，%Z-HL腔對基因突變或化學(xué)修飾敏感，以實(shí)現(xiàn)特異性檢測。

1.2 Aerolysin納米孔

Aerolysin是一種從嗜水氣單胞菌中提取的%[-致孔菌，是一種革蘭氏陰性桿菌，與人體腹瀉和深部傷口有關(guān)。成熟的Aerolysin可以與真核細(xì)胞膜表面的糖蛋白受體相互作用。合并并插入細(xì)胞膜形成孔，改變膜通透性并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Aerolysin單體在水溶液中自發(fā)形成具有蘑菇形狀的七聚體結(jié)構(gòu)，寬約15nm，高約7.0nm，孔徑為1.0至1.7nm。其形狀和存在廣泛用于納米孔技術(shù)的%Z-HL類似，但在順式末端沒有前庭結(jié)構(gòu)。

1.3 MspA納米孔

MspA是恥垢分枝桿菌恥垢分枝桿菌外膜的主要組分。MspA納米孔是由相對分子質(zhì)量為2.0？04的MspA單體蛋白構(gòu)成的同型八聚體，類似于在最窄點(diǎn)處直徑約1.2nm且長度約0.5nm的煙囪。這是一個很好的納米孔檢測傳感器。

1.4噬菌體phi29連接器

噬菌體phi29連接器主要由12個gp10亞基組成，形成～7.0nm通道，直徑3.6nm，開放端寬6.0nm。在高鹽強(qiáng)酸堿環(huán)境（pH=2.0-12）下，噬菌體phi29連接器通道仍能保持穩(wěn)定的通道特性。目前，關(guān)于噬菌體phi29連接器研究最多的是一種6-packRNA（pRNA）和ATPase蛋白gp16，它們組裝成噬菌體phi29包裝馬達(dá)，作為復(fù)雜的納米孔研究。由于通道的直徑較大，可以實(shí)現(xiàn)較大的生物分子如dsDNA和高分子量聚合物的檢測。

2生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展

迄今為止，DNA是納米孔研究中最常見的聚合物，脂質(zhì)嵌入的離子通道檢測DNA是該研究的突破性實(shí)例。最近，固態(tài)納米孔已被用于檢測核小體結(jié)構(gòu)和RNA聚合酶的差異，催化DNA轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部分，為理解染色體結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄研究創(chuàng)造了新的機(jī)會。一些蛋白質(zhì)在運(yùn)輸過程中“減壓”，運(yùn)輸過程可用于測量減壓動力學(xué)。已經(jīng)研究了許多這些蛋白質(zhì)的減壓行為，并且納米孔可以被動態(tài)地用作不需要標(biāo)記的高效力光譜儀。為了研究大腦對藥物的化學(xué)反應(yīng)，重要的神經(jīng)遞質(zhì)也被動態(tài)地實(shí)時區(qū)分開來。與其檢測技術(shù)相比，納米孔更有前途，效率高，速度快，價格低廉，且具有良好的準(zhǔn)確性和檢測性能。

2.1大型固態(tài)納米孔可以用來動態(tài)地捕獲釋放的細(xì)菌

為動態(tài)捕獲單個單元提供更快，更便宜的方法。使用脂肽涂覆的固態(tài)納米孔，可以檢測到DNA與相鄰孔隙膜的相互作用。熱反應(yīng)性聚合物的發(fā)展促進(jìn)了智能納米孔的發(fā)展。智能納米孔可以用作動態(tài)響應(yīng)溫度的裝置，由電解質(zhì)刷組成的生物納米孔可以控制孔附近的鹽電導(dǎo)。

納米孔的DNA測序也已取得進(jìn)展。最近的分子動力學(xué)研究表明，使用DNA聚合酶作為棘輪，通過控制DNA單鏈在石墨烯納米孔上的轉(zhuǎn)運(yùn)可以獲得核苷酸序列的高精度讀數(shù)。在溶血素中使用鏈霉抗生物素蛋白可以選擇性地固定DNA鏈，這可以高分辨率地區(qū)分孔上不同幾何位置的核酸。P-n半導(dǎo)體結(jié)降低了DNA易位速率，可以在位移過程中動態(tài)控制電壓。采用新型基于CMSO的放大器，可以實(shí)現(xiàn)亞微秒級的電流檢測。關(guān)于DNA測序的理論研究，已經(jīng)提出了可行的建議和方法來解決上述對離子電流測量速度的限制。模擬顯示石墨烯碳納米帶上的納米孔可以使用孔邊緣處的電流密度，導(dǎo)致更高的分辨率。也已經(jīng)提出了垂直于納米通道放置的石墨烯碳納米帶的電導(dǎo)變化作為DNA堿基易位測序裝置。

2.2有機(jī)小分子檢測

生物納米孔在直接檢測小有機(jī)分子方面有一些困難。如果分子適配器可以引入到納米孔中，則適配器和分析物之間的特定相互作用可以用于檢測小的有機(jī)分子。適配器通常是一個圓形分子，它在納米孔內(nèi)以非共價方式連接到孔壁，并充當(dāng)納米孔和小分子之間相互作用的介質(zhì)。

3結(jié)束語

生物納米孔分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于DNA測序、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究及單分子檢測等領(lǐng)域，且應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷拓寬。然而，作為一種新穎的單分子分析手段，納米孔技術(shù)在實(shí)際樣品檢測、數(shù)據(jù)處理和檢測裝置等方面也存在著諸多挑戰(zhàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] Kasianowicz，J.J.&E.Brandin;&D.Branton;，etal.CharacterizationofIndividualPolynucleotideMoleculesUsingaChannel[J].ProcNatlAcadSciUSA，2016，93（24）：13770-13773.