FGF2通過(guò)MAPK信號(hào)通路影響奶牛乳腺分支形態(tài)變化

崔英俊，于廣璞，湯云飛，孫 喆，張 莉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

乳房腺體由具有分支形態(tài)的腺體小葉構(gòu)成。妊娠早期乳腺分支階段短側(cè)枝形成，為分泌腺泡提供發(fā)育平臺(tái)[1]。妊娠期腺泡細(xì)胞數(shù)量和功能分化決定后續(xù)產(chǎn)奶能力，分支形態(tài)發(fā)生是腺泡發(fā)育和泌乳前提。

乳腺分支體外研究普遍使用三維培養(yǎng)，有利于研究乳腺組織體內(nèi)發(fā)育、形態(tài)發(fā)生和細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)。Ⅰ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，在三維培養(yǎng)時(shí)為組織提供力學(xué)環(huán)境，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，增加相關(guān)乳蛋白合成持續(xù)性，還可保存和運(yùn)輸細(xì)胞外基質(zhì)分泌的生長(zhǎng)因子以應(yīng)對(duì)組織損傷修復(fù)[2]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF2）作為公認(rèn)的誘導(dǎo)分支形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞因子，廣泛用于三維培養(yǎng)。

20世紀(jì)90年代，學(xué)者利用雌性小鼠乳腺類器官，使用I型膠原并添加相關(guān)細(xì)胞因子作三維培養(yǎng)，在體外重現(xiàn)乳腺導(dǎo)管發(fā)育后，該培養(yǎng)模型廣泛用于研究肺、唾液腺、腎臟、血管和乳腺導(dǎo)管發(fā)育[3]。在國(guó)內(nèi)研究中，該培養(yǎng)模型多應(yīng)用于肺[4]、胰腺[5]、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)[6]，關(guān)于乳腺組織應(yīng)用鮮有報(bào)道。以往乳腺分支研究多以小鼠為主，無(wú)法代替反芻動(dòng)物乳腺分支情況。為明確FGF2誘導(dǎo)奶牛乳腺分支過(guò)程中涉及信號(hào)通路，本文利用青春期奶牛乳腺類器官作三維培養(yǎng)，利用FGF2誘導(dǎo)類器官分支，確定FGF2在奶牛乳腺分支過(guò)程中起作用的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺組織

采集無(wú)菌新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織，無(wú)菌生理鹽水保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑

Ⅳ型膠原酶購(gòu)自VETEC公司；鼠尾Ⅰ型膠原購(gòu)自Solarbio公司；DMEM/F12，F(xiàn)GF2，PD173074（FGFR1受體抑制劑）， LY-294002（PI3K/AKT通路抑制劑），U0126（MAPK/ERK通路抑制劑），ITS，DnaseⅠ內(nèi)切酶等購(gòu)自Gibco公司；一抗p-AKT、 AKT、p-ERK、 ERK、 GAPDH 購(gòu) 自 CELL SIGNALING公司，RIPA（強(qiáng)）裂解液購(gòu)自上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺類器官獲得及三維培養(yǎng)

將新鮮健康青春期荷斯坦奶牛乳腺組織剪成小塊，加入DMEM/F12溶液（含1 mg·mL-1Ⅳ型膠原酶），37℃消化3 h，過(guò)濾。將濾液分裝在預(yù)鋪好2.5%BSA離心管中，1 500 r·min-1離心15 min，沉淀中加入2 000 U·mL-1的DnaseⅠ混勻靜置5 min，重懸細(xì)胞沉淀，放入離心機(jī)中1 500 r·min-13～4 s，收集沉淀，對(duì)類器官計(jì)數(shù)。

在24孔板上預(yù)鋪Ⅰ型膠原（pH 7.0～7.5），待Ⅰ型膠原完全凝固后，將類器官與Ⅰ型膠原（終濃度為3 mg·mL-1）混勻（1 000個(gè)類器官·mL-1Ⅰ型膠原），加入預(yù)鋪24孔板。待完全凝固后，按照不同組別加入培養(yǎng)基。對(duì)照組培養(yǎng)基為含1%雙抗，1%ITS的DMEM/F12培養(yǎng)基；FGF2組培養(yǎng)基在對(duì)照組基礎(chǔ)上加入FGF2（終濃度50 ng·mL-1）。FGF2+PD173074組、FGF2+LY-294002組及FGF2+U0126組培養(yǎng)基則在FGF2組基礎(chǔ)上分別加入PD173074（FGFR1抑制劑，10μmol·mL-1）、LY-294002（PI3K 抑制劑，10 μmol·mL-1）、U0126（MAPK/ERK抑制劑，10μmol·mL-1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84 h。隨后用DFC280倒置相差顯微鏡觀察類器官形態(tài)并拍照，每組隨機(jī)挑選放大倍數(shù)為40倍的3個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)類器官總數(shù)均大于50個(gè)，計(jì)數(shù)。分支率計(jì)算公式：分支形態(tài)類器官/類器官總數(shù)×100%。

1.2.2 Western blot檢驗(yàn)通路蛋白

D'Hank清洗孔板，每孔加RIPA裂解液100μL，4℃搖床過(guò)夜，之后14 000 r·min-1離心15 min，取上清。加入上樣緩沖液，100℃加熱10 min后超聲3次，每次15 s。樣品置于-80℃保存。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白濕轉(zhuǎn)至NC膜。用TBST洗膜，5%脫脂乳封閉。一抗4℃孵育過(guò)夜；二抗37℃孵育1～1.5 h。超敏發(fā)光液曝光。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

使用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)Western Blot結(jié)果掃描并作灰度分析；采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)，每組3次重復(fù)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）”表示，不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺三維培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)照組、FGF2組、FGF2+PD173074組、FGF2+LY-294002組、FGF2+U0126組作形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、FGF2+PD173074組和FGF2+U0126組在84 h時(shí)無(wú)明顯分支形態(tài)變化（見(jiàn)圖1A、C、E）而FGF2組和FGF2+LY-294002組在培養(yǎng)84 h時(shí)具有分支形態(tài)學(xué)變化（見(jiàn)圖1B、D箭頭處）。

2.2 奶牛乳腺三維培養(yǎng)中分支率計(jì)算

計(jì)算各組分支率后，可知FGF2組在84 h時(shí)，分支率顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；FGF2+LY294002組在84 h時(shí)，分支率顯著高于對(duì)照組但低于FGF2組（P＜0.05）；對(duì)照組、FGF2+PD193074組和FGF2+U0126組在84 h時(shí)分支率無(wú)顯著差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖2）。

圖1 84 h時(shí)奶牛乳腺類器官在三維培養(yǎng)中形態(tài)學(xué)變化Fig.1 Morphogenesischangeof dairy cow mammary organoidsin three-dimensional cultureat 84 h

圖2 奶牛乳腺類器官在三維培養(yǎng)中84 h時(shí)分支率Fig.2 Branching rateof dairy cow mammary organoids in three-dimensional cultureat 84 h

2.3 信號(hào)通路蛋白表達(dá)

0、15、60、240和600 min時(shí)各組AKT和ERK蛋白表達(dá)如圖3、4、5所示，各組在各檢測(cè)點(diǎn)AKT和ERK蛋白總量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。p-ERK和p-AKT蛋白表達(dá)如圖6、7所示。Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)GF2組p-AKT和p-ERK蛋白在0 min均未表達(dá)，但隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)不斷升高（見(jiàn)圖6、7）。與FGF2組相比，F(xiàn)GF2+PD173074組p-ERK蛋白在0、15和60 min時(shí)無(wú)顯著差異，240和600 min時(shí)p-ERK蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（見(jiàn)圖7）；而p-AKT蛋白各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）（見(jiàn)圖6）。與FGF2組相比，F(xiàn)GF2+LY-294002組p-ERK蛋白隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；但在600 min時(shí)表達(dá)量顯著高于FGF2+U0126組和FGF2+PD173074組（P＜0.05）（見(jiàn)圖7）。FGF2+LY-294002組p-AKT相對(duì)表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于FGF2組（P＜0.05）（見(jiàn)圖6）。與FGF2組相比，F(xiàn)GF2+U0126組p-ERK蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P＜0.05）（見(jiàn)圖7）；FGF2+U0126組p-AKT蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于FGF2組（P＜0.05），但均顯著高于FGF2+LY-294002組和FGF2+PD173074組（P＜0.05）（見(jiàn)圖6）。

圖3 AKT和MAPK信號(hào)通路主要蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of major proteinsin AKT and MAPK signaling pathways

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Protein expression of AKT in different time point

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Protein expression of ERK in different timepoint

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.6 Protein expression of p-AKT in different timepoint

圖7 不同時(shí)間點(diǎn)p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Protein expression of p-ERK in different time point

3 討論

3.1 FGF2對(duì)奶牛乳腺分支作用

FGF2可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖[7]，參與包括小鼠乳腺上皮[8]、肺上皮[9]、唾液腺上皮[10]等多種組織分支形態(tài)發(fā)生。FGF2在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞和腺泡上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[11]。FGF2與乳腺分支形成密切相關(guān)，可控制小鼠乳腺導(dǎo)管延長(zhǎng)，促進(jìn)乳腺發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖和乳腺上皮擴(kuò)張[12]。但FGF2對(duì)奶牛乳腺上皮分支作用未見(jiàn)報(bào)道。

本研究利用鼠尾Ⅰ型膠原鑲嵌法對(duì)奶牛乳腺類器官三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在FGF2作用下，與對(duì)照組相比，奶牛乳腺類器官84 h發(fā)生明顯分支形態(tài)學(xué)變化，且分支率顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明FGF2可使奶牛乳腺分支形成，與Kashimata等利用小鼠乳腺作三維培養(yǎng)結(jié)果一致[13]。

3.2 FGFR1對(duì)FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生作用

FGF2受體為四種FGF受體酪氨酸激酶：FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。在青春期小鼠末端乳芽和乳腺導(dǎo)管上皮切片中，通過(guò)原位雜交可檢測(cè)Fgfr1和Fgfr2RNA，但無(wú)Fgfr3和Fgfr4RNA表達(dá)[14]。Pond等研究表明，F(xiàn)GF受體（FGFR1和FGFR2）缺失導(dǎo)致有缺陷乳腺分支形態(tài)發(fā)生[15]。本研究在添加PD193074（FGFR1抑制劑）后，發(fā)現(xiàn)84 h時(shí)FGF2+PD193074組無(wú)明顯分支形態(tài)發(fā)生，分支率顯著低于FGF2組。通路蛋白檢測(cè)中同樣發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2+PD193074組p-ERK和p-AKT蛋白表達(dá)顯著低于FGF2組。因此推斷，F(xiàn)GF2在調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生過(guò)程中，以FGFR1為主要結(jié)合受體。

3.3 MAPK通路對(duì)FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生作用

FGF2與其受體結(jié)合后，一種途徑是激活Raf/MAPK，Raf將信號(hào)轉(zhuǎn)遞給ERK1/2，活化ERK1/2將信號(hào)傳遞給核糖體激酶P90S6K和P70S6K，活化核糖體S6入核參與蛋白合成；另一個(gè)途徑是激活A(yù)KT，將信號(hào)傳遞給JNK和ERK1/2，同樣刺激核糖體活化，參與蛋白合成[16]。MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，凋亡和細(xì)胞遷移[17]；AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、代謝、增殖、遷移[18]。在果蠅氣管形成、小鼠頜下腺分支形態(tài)發(fā)生及小鼠乳腺試驗(yàn)中均證實(shí)MAPK信號(hào)通路與形態(tài)學(xué)發(fā)生有關(guān)[19]?？梢?jiàn)在不同組織中，MAPK通路在分支形態(tài)形成過(guò)程中均為保守重要節(jié)點(diǎn)。目前MAPK通路調(diào)節(jié)分支延伸具體機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果表明，在U0126抑制p-ERK蛋白表達(dá)時(shí)，84 h時(shí)FGF2+U0126組奶牛乳腺類器官分支率顯著低于FGF2組和FGF2+LY-294002組，但與對(duì)照組相比差異不顯著，證明MAPK/ERK信號(hào)通路是決定奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生主要途徑。

AKT和AKT下游JNK促進(jìn)ERK1/2活化[20]，由此推斷PI3K/AKT信號(hào)通路可能通過(guò)影響ERK活化影響奶牛乳腺分支形態(tài)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LY-294002抑制p-AKT蛋白表達(dá)時(shí)，F(xiàn)GF2+LY-294002組的p-ERK蛋白表達(dá)顯著高于FGF2+U0126組但低于FGF2組，表明LY-294002可能影響ERK磷酸化；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2+LY-294002組奶牛乳腺分支率顯著高于對(duì)照組但低于FGF2組，表明PI3K/AKT信號(hào)通路可能影響奶牛乳腺分支形態(tài)。當(dāng)U0126發(fā)揮作用時(shí)，即使p-AKT蛋白表達(dá)顯著高于FGF2+LY-294002組，此時(shí)培養(yǎng)的奶牛乳腺類器官在形態(tài)學(xué)上并未觀察到明顯分支，說(shuō)明PI3K/AKT信號(hào)通路并非奶牛乳腺分支形態(tài)產(chǎn)生主要途徑，推測(cè)其單獨(dú)作用難以影響奶牛乳腺分支形成。

4 結(jié)論

綜上所述，利用FGF2在Ⅰ型膠原中成功刺激奶牛乳腺類器官產(chǎn)生分支結(jié)構(gòu)。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和信號(hào)通路蛋白檢測(cè)，明確FGF2通過(guò)FGFR1受體激活MAPK/ERK信號(hào)通路，對(duì)奶牛乳腺分支形成發(fā)揮作用。MAPK信號(hào)通路為FGF2調(diào)節(jié)奶牛乳腺分支形態(tài)發(fā)生主要信號(hào)通路。