不同培養(yǎng)條件對(duì)翠云草顏色的影響

金卓　丁濱　王照磊　倪鑫濤　王超

摘 要：本研究通過(guò)拍照、利用CAD軟件計(jì)算對(duì)比明確了0.2mg/L 2，4-D（2，4- 二氯苯酚代乙酚）能顯著促進(jìn)翠云草生長(zhǎng)；激素和土壤對(duì)翠云草葉色變化影響不明顯；翠云草葉片中葉綠素a/b比值為2.26±0.04；在藍(lán)色光照射下葉片中兩種葉綠素含量顯著增加，單克葉片中PAL的活性和翠雀素-3-O-葡萄糖的濃度顯著增加，肉眼觀(guān)察翠云草葉片呈藍(lán)色。

關(guān)鍵詞：翠云草；培養(yǎng)條件；葉綠素；翠雀素；苯丙氨酸解氨酶（PAL）

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.35 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-2945（2018）21-0046-03

Abstract： In this study， it was found that 0.2 mg/L 2o-D（2， 4-dichlorophenol） could significantly promote the growth of Turquoise grass by taking photos and calculating and contrasting with CAD software， but the effects of hormones and soil on the leaf color of Turquoise grass were not obvious. The ratio of chlorophyll a/b was 2.26±0.04. Under blue light irradiation， the contents of chlorophyll in leaves increased significantly， the activity of PAL and the concentration of aliphin-3-O-glucose in single gram leaves increased significantly. The leaves of Turquoise grass showed blue color by naked eye observation.

Keywords： Turquoise grass； culture condition； chlorophyll； lark； phenylalanine ammonia-lyase （PAL）

翠云草（Selaginella uncinnata）屬蕨類(lèi)石松亞門(mén)卷柏屬多年生草本植物，別稱(chēng)藍(lán)地柏、綠絨草、藍(lán)草等，是一種在我國(guó)南部山區(qū)較為常見(jiàn)的蕨類(lèi)。翠云草，因其特有性質(zhì)和嬌俏外形而具有“動(dòng)靜”兩方面的應(yīng)用價(jià)值：“動(dòng)”可藥用[1]，已有研究發(fā)現(xiàn)翠云草中富含黃酮、酚類(lèi)、甾體皂苷類(lèi)等化學(xué)成分[2-3]，具有一定的抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、平喘、祛痰止咳、抗菌等活性[4-5]，現(xiàn)己建立起合理可行的質(zhì)量控制方法，具有較好的開(kāi)發(fā)前景；“靜”可觀(guān)賞，翠云草布葉勻稱(chēng)，蔓生抬頭， 為小型觀(guān)葉植物。翠云草株態(tài)靈奇，全年翠綠光潤(rùn)偶帶藍(lán)色熒光，在花卉市場(chǎng)上是十分暢銷(xiāo)的觀(guān)葉盆栽[6]。室內(nèi)做盆栽裝點(diǎn)，室外還可做植被點(diǎn)綴，且水培、土培和沙培皆宜，效果別具一格。

在實(shí)際培育翠云草的過(guò)程中，由于其有生長(zhǎng)速度慢，受環(huán)境影響大，藍(lán)葉色不易顯現(xiàn)等現(xiàn)象，很難以觀(guān)賞植物的角色在我國(guó)商業(yè)化。本實(shí)驗(yàn)著眼于影響翠云草生長(zhǎng)和葉色變化的各種因素的優(yōu)化，得到了一組易于翠云草生長(zhǎng)和其葉色顯藍(lán)的環(huán)境參數(shù)。

1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用翠云草于浙江省溫州市雁蕩山采集（北緯28°21′52″東經(jīng)121°5′0″海拔200米左右），經(jīng)由浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定確為翠云草（Selaginella uncinnata）。本研究所用試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實(shí)驗(yàn)器材包括立式壓力蒸汽滅菌鍋，型號(hào)YXQ-LS-100SII，購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；pH計(jì)，實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) FiveEasy，購(gòu)于Mettler Toledo；電熱恒溫水槽，型號(hào)DK-450B，購(gòu)于上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；分光光度計(jì)，型號(hào)Ultrospec 3300pro UV/Visible Spectrophotometer，購(gòu)于A(yíng)mersham Biosciences；冷凍離心機(jī)，購(gòu)于Thermos Scientific；高效液相色譜，Ultimate3000；色譜柱，Acclaim 120 C18 5um 120A 4.6X250m

m，購(gòu)于Dionex。

2 方法

2.1 培養(yǎng)條件對(duì)翠云草葉色的影響

采用恒溫溫室培養(yǎng)，溫度控制為25±2℃；在翠云草生長(zhǎng)期間保持培養(yǎng)基不干燥，保持葉片的濕潤(rùn)。在篩選最適激素實(shí)驗(yàn)中，選取長(zhǎng)勢(shì)良好、生長(zhǎng)茂盛、有藍(lán)綠色光澤且含一個(gè)不定根的翠云草莖分別培養(yǎng)在含不同激素的1/2 MS（pH 6.0）無(wú)糖培養(yǎng)基中（詳見(jiàn)表1）。在5個(gè)實(shí)驗(yàn)周期間，每周觀(guān)察兩次其生長(zhǎng)及葉色的變化，利用平行拍攝和Auto CAD軟件對(duì)比分析其根長(zhǎng)、株長(zhǎng)的變化。

土壤實(shí)驗(yàn)中選擇紅土、黃土和泥炭土三種常見(jiàn)的觀(guān)賞植物用土作為變量，在其它條件相同情況下培養(yǎng)，觀(guān)察翠云草葉色的變化。

光質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)中采用不同波長(zhǎng)的LED燈為光源，分別為紅光（620-625nm）、橙光（585-590nm）、綠光（520-525nm）、藍(lán)光（465-470nm）、白光（390-780nm）、無(wú)光源照射六個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在其它條件相同情況下，培養(yǎng)觀(guān)察葉色的變化。

2.2 葉綠素和翠雀素含量的測(cè)定

參考王二雷[7]測(cè)定藍(lán)莓中翠雀素含量的方法，用高效液相色譜比積法測(cè)定翠雀素含量。采用80%丙酮提取翠云草中的葉綠素，含量測(cè)定方法參考2008年崔曉靜的研究[8]。

2.3 PAL活性的測(cè)定

根據(jù)崔曉靜研究中的方法測(cè)定PAL活性[8]，以L(fǎng)-苯丙氨酸（L-phe）為底物，翠云草葉片組織作為酶源，酶促生成產(chǎn)物反式-肉桂酸（t-Ca）測(cè)定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的紫外分光光度法。

3 結(jié)果

3.1 激素對(duì)翠云草生長(zhǎng)和葉色的影響

通過(guò)拍照和Auto CAD軟件分析發(fā)現(xiàn)，0.2mg/L NAA、0.5mg/L KT及0.5mg/L 6-BA對(duì)翠云草根和植株均沒(méi)有明顯的促生作用，累計(jì)增長(zhǎng)率未超過(guò)10%。并且在0.5mg/L 6-BA的影響下翠云草根部甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)的現(xiàn)象。0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4能夠顯著促進(jìn)翠云草根生長(zhǎng)，累計(jì)增長(zhǎng)26.33%（P<0.05），但對(duì)翠云草株長(zhǎng)影響不大。0.2mg/L 2，4-D則對(duì)根和地上部分都有明顯促增長(zhǎng)作用，分別為13.48%和25.56%（P<0.05詳見(jiàn)圖1，2）。

六周后對(duì)翠云草的葉色進(jìn)行對(duì)比觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)總體各組別葉色均沒(méi)有顯著變化。0.5mg/L KT和0.5mg/L 6-BA組葉片略顯黃色，0.2mg/L NAA和0.2mg/L 2，4-D組較未處理組更綠，而0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4組未見(jiàn)變化。

3.2 土壤對(duì)翠云草的影響

在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中我們以0.2mg/L 2，4-D 1/2MS培養(yǎng)液澆灌，分別以黑土、紅土、泥炭土以及雁蕩山當(dāng)?shù)赝寥罏榛|(zhì)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)在不同的土質(zhì)比較實(shí)驗(yàn)中，翠云草在黑土、紅土和泥炭土條件下的生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異，因而仍采用雁蕩山土質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（詳見(jiàn)圖3）

3.3 光質(zhì)對(duì)翠云草生長(zhǎng)和葉色變化的影響

在光質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，目測(cè)藍(lán)光（465-470nm）和白光（390-780nm）照射下翠云草生長(zhǎng)較迅速，在藍(lán)光葉片變藍(lán)。

3.3.1 葉綠素含量的定量分析

在實(shí)驗(yàn)前、后取不同組翠云草葉片，分別定量分析其中葉綠素a、b的含量，計(jì)算葉綠素a與b值（表3）。對(duì)比發(fā)現(xiàn)翠云草葉綠素a/b值為2.26±0.04，不同波長(zhǎng)照射對(duì)葉綠素a、b含量影響不同。紅光照射后葉綠素a含量降低而葉綠素b含量增加，葉綠素a/b值降到0.61。而藍(lán)色光照射后兩種葉綠素含量增加明顯，葉綠素a/b值為1.05。作為對(duì)照，白光和無(wú)光照培養(yǎng)條件下葉綠素a/b值幾乎不變。

3.3.2 翠雀素含量

在本實(shí)驗(yàn)以藍(lán)莓中的矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車(chē)菊素-3-O-半乳糖苷、翠雀素-3-O-葡萄糖苷以及翠雀素-3-O-半乳糖苷為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)HPLC法對(duì)翠云草中翠雀素進(jìn)行半定量分析，其中翠雀素-3-O-葡萄糖苷在不同光質(zhì)照射下含量有所變化，如圖4所示。

3.3.3 PAL活性

PAL是植物中催化酚類(lèi)次生代謝產(chǎn)物合成的重要蛋白質(zhì)，與翠雀素合成有關(guān)。在對(duì)該酶酶活性連續(xù)6周的跟蹤測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，紅、藍(lán)光對(duì)PAL活性有顯著影響，PAL活性增長(zhǎng)率超過(guò)300%，達(dá)到350U/g；而橙、白光對(duì)PAL活性影響不大，始終維持在100-200U/g；PAL活性在綠光和無(wú)光條件下明顯降低（見(jiàn)圖5）。

4 結(jié)束語(yǔ)

為保證有足夠的實(shí)驗(yàn)材料，我們首先通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出最適合翠云草生長(zhǎng)的培養(yǎng)基配方和土壤基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)含0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4（pH6.0）的1/2 MS不含糖培養(yǎng)基對(duì)翠云草生根最為有利，而0.2mg/L 2，4-D能夠同時(shí)促進(jìn)翠云草根和地上部分生長(zhǎng)。有實(shí)驗(yàn)證明0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4促翠云草生根的作用與其它蕨類(lèi)植物作用相似[9-10]，2，4-D還能夠誘導(dǎo)烏毛蕨[11]等蕨類(lèi)植物形成愈傷組織，而激素、土質(zhì)對(duì)翠云草葉色影響不大。

翠云草是一種陰生植物，葉片中葉綠素a/b的比值在2左右，能夠更充分利用短波長(zhǎng)的光，即藍(lán)紫光。在光質(zhì)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)比分析葉綠素a、葉綠素b和花青素中的一種翠雀素的含量，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)藍(lán)光照射三種葉綠素的含量均有增加，葉綠素b和翠雀素-3-O-半乳糖苷含量明顯增加。張水木等[12]用不同顏色彩色膜和遮蔭處理的室外光照條件下培養(yǎng)翠云草，發(fā)現(xiàn)翠云草在不同光質(zhì)條件下色素苷的含量變化極明顯，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致，而葉綠素含量變化不明顯，推測(cè)是由于培養(yǎng)條件不同導(dǎo)致。翠雀素是植物花色和葉色呈現(xiàn)藍(lán)色的主要成分原因，PAL則是翠云草色素苷合成反應(yīng)的首個(gè)關(guān)鍵酶，其活性的變化直接能改變翠云草葉色的變化。在藍(lán)光照射下翠云草葉片中PAL活性也顯著上升，增加3.5倍，而翠雀素-3-O-半乳糖苷含量變化不大（陰性結(jié)果未展示），推測(cè)可能是因?yàn)槿鄙俅淙杆?3-O-半乳糖苷合成有關(guān)的底物或蛋白。

本研究對(duì)藍(lán)色翠云草的室內(nèi)培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步探索，為種植和推廣該變色的觀(guān)賞植物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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