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    復(fù)方多糖的葡聚糖凝膠分離及純度鑒定

    2018-09-13 19:19鄭亞玲
    食品安全導(dǎo)刊 2018年8期
    關(guān)鍵詞:分離純化多糖

    鄭亞玲

    摘 要:本文研究了在離子交換分離的基礎(chǔ)上,用葡聚糖凝膠色譜進(jìn)一步優(yōu)化分離純化復(fù)方多糖的方法和條件,從而建立葡聚糖凝膠分離此復(fù)方多糖的最佳條件。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)洗脫液的濃度進(jìn)行選擇,分別用不同濃度的NaCl溶液為洗脫劑,根據(jù)所得吸光度曲線的峰形及對(duì)稱情況,判斷出最佳的洗脫劑濃度為0.2mol·L-1NaCl溶液;再將分離純化所得的復(fù)方多糖用紙層析法、紫外-可見(jiàn)吸收光譜、凝膠色譜法進(jìn)行純度鑒定,經(jīng)鑒定可知分離所得的復(fù)方多糖為均一組分。

    關(guān)鍵詞:多糖 分離純化 純度鑒定

    多糖廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、植物和微生物細(xì)胞壁中,是一類(lèi)天然高分子化合物,其在抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗?jié)?、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等方面有良好的應(yīng)用前景[1]。

    凝膠色譜[2]又稱分子篩色譜,凝膠柱色譜法常用的凝膠有葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠,以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑,可使不同大小的多糖分子得到分離純化,但不適宜粘多糖的分離[3]。多糖是極性大分子化合物,具有分子量、組成、聚合度、分子形狀不均一的特點(diǎn)[4]。測(cè)定多糖純度的方法有功能團(tuán)分析、比旋光度、水解后糖組分分析、紙色譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜法和高效液相色譜、超離心和高壓電泳、超離心分析法等[2]。

    1檢測(cè)方法

    1.1 紙色譜法

    紙色譜法[5]是以濾紙作為載體,讓樣品溶液在濾紙上展開(kāi)。紙色譜的溶劑由有機(jī)溶劑和水組成,當(dāng)有機(jī)溶劑和水部分溶解時(shí)則有兩種可能——一相是以水飽和的有機(jī)溶劑相,一相是以有機(jī)溶劑飽和的水相。紙色譜中的流動(dòng)相是指層析液在毛細(xì)拉力作用下能不斷由下向上流動(dòng),固定相是指被吸附在濾紙纖維之間的水分。由于纖維素上的羥基具有親水性,故使這部分水束縛在纖維素周?chē)灰讛U(kuò)散而成為固定相。在層析過(guò)程中,當(dāng)層析液在毛細(xì)拉力作用下上升,流經(jīng)色素濾液細(xì)線時(shí),濾液細(xì)線上的色素就相繼溶入層析液,隨著層析液上升發(fā)生再分配,即有一部分色素從層析液分配溶解到固定相中,直到平衡。由于分配系數(shù)不同,那些分配系數(shù)大的色素分子隨層析液向上移動(dòng)得快,形成的色素帶集中在濾紙上部;而分配系數(shù)小的色素分子,隨層析向上移動(dòng)得慢,形成的色素帶集中在濾紙下面。

    1.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜法

    一種純物質(zhì)在一定條件、一定波長(zhǎng)范圍內(nèi),它的吸收光譜是一定的。根據(jù)物質(zhì)吸收光譜最大吸收峰波長(zhǎng)的位置或吸收峰形狀和數(shù)量,可以判斷該物質(zhì)的純度。對(duì)于某些生物大分子(如核酸和蛋白質(zhì)),可以根據(jù)他們?cè)谧贤夤鈪^(qū)的特征吸收峰波長(zhǎng)(如核酸260nm,蛋白質(zhì)280nm)處測(cè)得吸光值,可通過(guò)求二者吸光值的比值來(lái)判斷純度。

    1.3 凝膠色譜法

    凝膠色譜也可用于多糖的純度鑒定——若經(jīng)凝膠色譜得到單一對(duì)稱峰,說(shuō)明該多糖為均一組分。

    2 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

    儀器:電子天平、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、超聲波清洗器、電熱真空干燥箱、層析柱(3cm×100cm)、層析缸(7cm×25cm)。

    試劑:葡聚糖凝膠、磷酸、正丁醇、丙酮、醋酸、氯化鈉、濃硫酸、苯酚、苯胺、鋅粉等(均為分析純?cè)噭?/p>

    原料:復(fù)方多糖樣品(已經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂初步分離)。

    3 實(shí)驗(yàn)方法

    3.1 多糖的分離純化

    3.1.1 裝柱、平衡

    稱取葡聚糖干粉20.0g,在90℃蒸餾水中溶脹5h。溶脹平衡后,在凝膠顆粒面上加較多的水,用攪棒將凝膠攪勻,放置數(shù)分鐘,將沉降很慢的細(xì)顆粒隨上層水到掉,如此反復(fù)至上層沒(méi)有細(xì)顆粒為止。向洗好的凝膠中加入2倍凝膠體積的NaCl溶液,放置于80℃水中加熱30~40min以排除凝膠溶液中的氣泡,同時(shí),另取200mL同濃度的NaCl溶液在80℃水中加熱以排除溶液中的氣泡,以備裝柱時(shí)用。

    除完氣泡后,選長(zhǎng)為100.0cm、外徑為3.0cm的層析柱開(kāi)始裝柱。將除好氣泡的200mL NaCl溶液倒入柱中,再將已做好的薄棉花片鋪于柱底,把凝膠溶液攪勻倒進(jìn)柱中,待柱底面上積起約1~2cm的凝膠床后,打開(kāi)柱的出口,隨著下面水的流出上面不斷加入凝膠,并不斷輕敲四周柱壁,使形成的凝膠床面上有均勻連續(xù)的凝膠降下,得到均勻的凝膠柱。裝好凝膠柱后,量算出有效柱體積,用3~5倍柱體積的NaCl溶液平衡凝膠柱。

    3.1.2 上樣、洗脫

    取0.1g樣品溶于0.1mol·L-1的NaCl溶液中,使其體積為柱體積的0.5%,將凝膠柱層面上的洗脫液放出至距床面小于0.5mm時(shí),用移液管將配制好的樣品溶液逐滴加在床面上,使樣品溶液均勻平鋪在凝膠床面上,待樣品溶液完全進(jìn)入凝膠柱后,向床面上緩緩加上10cm高的洗脫液,再逐滴加入洗脫液進(jìn)行洗脫,使加入洗脫液的速度與凝膠柱流速相等。

    計(jì)算凝膠柱流速及每分鐘流出的體積,每流出3mL收集一次,至流出液呈無(wú)色為止,停止收集。再分別用0.2mol·L-1、0.3mol·L-1、0.4mol·L-1、0.5mol·L-1NaCl溶液重復(fù)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟。

    3.1.3 洗脫劑濃度的選擇

    分別取收集的各瓶樣品溶液0.1mL,再依次加入1.0mL 5%苯酚、0.9mL蒸餾水和5.0mL濃硫酸,放置20min顯色后,在490nm下測(cè)其吸光度,并繪制吸收曲線,根據(jù)吸收曲線選擇最佳的洗脫劑濃度(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖表1~5)。

    3.2 純度鑒定

    3.2.1 紫外光譜法

    用電光天平稱取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0201g,配制成100mL溶液。取配制好的多糖溶液3.5mL、蒸餾水3.5mL,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200~400nm范圍內(nèi)每10nm測(cè)一次吸光度(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6)。

    3.2.2 凝膠色譜法

    取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.1g溶于7mL 0.2mol·L-1NaCl溶液中,上SephadexG-200層析柱(3.0×60cm),用0.2mol·L-1NaCl溶液洗脫,流速為54s/滴,分步收集,每30min收集一次,至流出液呈無(wú)色為止,停止收集,用苯酚-硫酸法檢測(cè)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7、圖6)。

    3.2.3 紙層析法

    稱取葡聚糖凝膠分離后的多糖0.0502g,加入10mL蒸餾水配成0.5%多糖溶液,濾紙尺寸為(4cm×23cm),以正丁醇:乙醇:水=4:1:5為展開(kāi)劑,室溫展開(kāi)6h,苯胺磷酸鹽為顯色劑,100℃,顯色10min。

    4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    4.1 洗脫效果與討論

    由圖1、圖2、圖3、圖4、圖5可以看出,以0.2mol·L-1NaCl溶液為洗脫劑所得的曲線峰形及對(duì)稱性較好,因此可確定用葡聚糖凝膠分離復(fù)方免疫增強(qiáng)劑中多糖的最佳洗脫劑為0.2mol·L-1的NaCl溶液。

    4.2 純度鑒定結(jié)果與討論

    4.2.1 紫外光譜法

    由以上數(shù)據(jù)可以看出,在260nm和280nm處樣品無(wú)吸收峰,說(shuō)明此多糖樣品中不含蛋白質(zhì)和核酸。

    4.2.2 凝膠色譜法

    由以上數(shù)據(jù)和圖形可以看出,得到的曲線是單一對(duì)稱峰,說(shuō)明此多糖樣品為均一組分。

    4.2.3 紙層析

    經(jīng)顯色烘干后可見(jiàn)濾紙上只有一個(gè)斑點(diǎn),可說(shuō)明此多糖樣品為均一組分。

    5 結(jié)論

    以0.2mol·L-1的NaCl溶液為洗脫劑,使用Sephadex G-200可有效分離純化復(fù)方免疫增強(qiáng)劑中多糖,達(dá)到最佳分離效果。

    經(jīng)紫外光譜法、凝膠色譜法、紙層析法、旋光度法鑒定,由Sephadex G-200分離純化出的復(fù)方多糖為均一組分。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 傅博強(qiáng),謝明勇,周鵬.茶葉多糖的提取純化、組成及藥理作用研究進(jìn)展.南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(理科版),2001,25(4):358-364.

    [2] 林卓坤.色譜法(一),科學(xué)出版社,1982.1:61-69.

    [3] 甘璐,張聲華.枸杞多糖純度與四個(gè)級(jí)分含量的測(cè)定.食品科學(xué),1999.1:52-53.

    [4] 張林維,趙幟平,沈業(yè)壽.當(dāng)歸多糖的分離純化及其部分性質(zhì)的研究.生物學(xué)雜志,1998,15(3):12-14.

    [5] 周光碗,胡曉倩.生物化學(xué)儀器分析與實(shí)驗(yàn)技術(shù).化學(xué)工業(yè)出版社,2003:9-22.

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