紫色紅曲霉FBKL3.0018液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酯化酶的工藝優(yōu)化

王 艷,吳鑫穎,胡 娜,唐佳代,王曉丹,王 嘯,*,邱樹毅,*

(1.貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學(xué),釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025)

短碳鏈羧酸酯是構(gòu)成白酒香味物質(zhì)的重要成分之一,在白酒釀造過程中由微生物產(chǎn)生的酯化酶能使呈香前體轉(zhuǎn)化為香味物質(zhì)[1-2]。因此,從白酒生產(chǎn)中篩選高產(chǎn)酯化酶的微生物以及強(qiáng)化其產(chǎn)酯能力,對白酒尤其是濃香型白酒起到增香和提高酒質(zhì)具有重要意義[3-5]。

酯化酶來源遍及動物、植物和微生物,但目前研究較多且工業(yè)上常用的酯化酶大多數(shù)來源于微生物,自然界能產(chǎn)酯化酶的微生物種類繁多,例如細(xì)菌、根霉、紅曲霉、酵母、放線菌等[6-8]。而在白酒生產(chǎn)過程中常見的產(chǎn)酯化酶微生物主要有細(xì)菌、根霉、紅曲霉[9-11]。紅曲霉在發(fā)酵培養(yǎng)過程中能分泌多種生理活性物質(zhì),如酯化酶、α-淀粉酶、糖化酶、紅曲色素、麥角固醇、γ-氨基丁酸等,不同菌株所產(chǎn)生理活性物質(zhì)會存在一定差異,引起全球相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的熱切關(guān)注[12-14]。本文采用的FBKL3.0018分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲[15],其來源十分安全,通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化實驗,可有效提高該菌株在白酒生產(chǎn)上的應(yīng)用價值。

本實驗采用液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng),通過單因素實驗、Plackett-Burman實驗和響應(yīng)面試驗對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶進(jìn)行研究,通過考察發(fā)酵培養(yǎng)基組和培養(yǎng)條件對產(chǎn)酯化酶活性的影響,對產(chǎn)酯化酶工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高該菌生產(chǎn)酯化酶的能力,為其更好地用于白酒釀造中生產(chǎn)香味物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

FBKL3.0018 分離自貴州某濃香型酒廠中溫大曲;麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA) 分析純,青島海博生物技術(shù)有限公司;麥芽糖、牛肉膏、蛋白胨 分析純,北京奧博星責(zé)任有限公司;碳源和氮源、α-乙酸萘酯、固蘭B鹽(Fast blue B salt) 純度≥99%,合肥博美生物科技有限責(zé)任公司(進(jìn)口分裝);其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

Thermo Fisher臺式高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;723型可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司制造;PHS-3CpH計 上海鴻蓋儀器有限公司;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市中大儀器廠;ZQPL-200振蕩培養(yǎng)箱 天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

斜面培養(yǎng)基:MEA。

種子培養(yǎng)基(%):4%葡萄糖,1.5%蛋白胨,0.15%七水硫酸鎂,pH自然,用蒸餾水配制,115 ℃濕熱滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):5%葡萄糖,2%蛋白胨,0.15%七水硫酸鎂,pH自然,用蒸餾水配制,115 ℃濕熱滅菌,30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 菌種活化 將轉(zhuǎn)接好的菌種斜面放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)活化5～7 d。

1.2.1.2 種子培養(yǎng) 將活化好的菌種用接種環(huán)刮至裝有玻璃珠的無菌生理鹽水中,30 ℃,160 r/min,振蕩1 h,經(jīng)無菌脫脂棉過濾后鏡檢,制成1×107～1×108個/mL的孢子懸液。按體積比7%的接種量將孢子懸液接種至裝有50 mL/250 mL種子培養(yǎng)液的三角瓶中30 ℃,160 r/min搖瓶培養(yǎng)18 h。

1.2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng) 按體積比7%的接種量將種子培養(yǎng)液接種至裝有50 mL/250 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中,30 ℃,160 r/min搖瓶培養(yǎng)90 h。

1.2.2 紫色紅曲霉液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酯化酶的優(yōu)化實驗設(shè)計

1.2.2.1 單因素實驗設(shè)計 單因素優(yōu)化的固定條件為:5%葡萄糖,2%蛋白胨,0.15%七水硫酸鎂,pH自然值,發(fā)酵溫度30 ℃,接種量7%(v/w),裝液量50 mL/250 mL,搖床轉(zhuǎn)數(shù)160 r/min,發(fā)酵時間72 h。優(yōu)化因素為培養(yǎng)基組分氮源(牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硝酸鈉)及最優(yōu)氮源濃度(1%、1.5%、2%、2.5%、3%),碳源(葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖)及最優(yōu)碳源濃度(2%、4%、6%、8%、10%、12%),無機(jī)鹽(無水氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸鋅、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀)及最優(yōu)無機(jī)鹽濃度(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%),pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),發(fā)酵溫度(23、27、31、35、39 ℃),接種量(3%、5%、7%、9%、11%、13%),裝液量(30、35、40、45、50、55、60、65、70 mL/250 mL),搖床轉(zhuǎn)數(shù)(120、140、160、180、200 r/min),發(fā)酵時間(24、48、72、96、120、144、168 h),以發(fā)酵液中酯化酶酶活為考察指標(biāo),對發(fā)酵培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素實驗,每組實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果取其均值。

1.2.2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,進(jìn)一步采用Design-Expert軟件中N=12的Plackett-Burman實驗設(shè)計,以酯化酶活性(U/mL)為響應(yīng)值,對培養(yǎng)基中的氮源、碳源、無機(jī)鹽、初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間進(jìn)行篩選,每個因素設(shè)置+1和-1水平,為了避免遮掩其他因素的重要性,+1水平取-1水平的1.25倍進(jìn)行實驗,每組實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果取其均值。PB實驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 Plackeet-Burman因素水平表

1.2.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)Plackett-Burman實驗設(shè)計結(jié)果,選取對酯化酶活性影響較顯著的蔗糖、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間三個因素為自變量,以酯化酶活性(U/mL)為響應(yīng)值,采用Box-Behnken進(jìn)行中心組合設(shè)計,進(jìn)行三因素三水平實驗,每組實驗重復(fù)3次,實驗結(jié)果取其平均值。BB實驗設(shè)計因素水平表見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.3 酯化酶活性測定 粗酶液的制備:發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵培養(yǎng)基過濾,真空抽濾,4 ℃,8000 r/min,離心8 min,收集上清液,用于酶活力測定。

酶活力定義:40 ℃條件下反應(yīng)10 min,每分鐘產(chǎn)生1.0 μmolα-萘酚所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 數(shù)據(jù)數(shù)據(jù) 利用Design-Expert 8.06軟件進(jìn)行Plackett-Burman實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析,Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 氮源對酯化酶活性的影響 2%的氮源對酯化酶活性的影響結(jié)果如圖1A所示,牛肉膏對酯化酶活性影響最大,酯化酶活為220.65 U/mL,氯化銨對酯化酶的分泌起抑制作用。相同實驗條件下,不同濃度的牛肉膏對酯化酶活性影響結(jié)果如圖1B所示,當(dāng)牛肉膏含量為2%時,酯化酶活性為225 U/mL。有機(jī)氮(牛肉膏)和無機(jī)氮(硝酸鈉)對酯化酶的分泌影響最大,因此選擇兩者進(jìn)行復(fù)配能更有效促進(jìn)酯化酶生產(chǎn),相同實驗條件下,實驗結(jié)果如圖1C所示,2%牛肉膏+0.3%硝酸鈉復(fù)配時,酯化酶活性為265.87 U/mL。

圖1 氮源對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.2 碳源對酯化酶活性的影響 碳源對酯化酶活性的影響結(jié)果如圖2A所示,蔗糖對酯化酶活性影響最大,酯化酶活性為279.79 U/mL。相同實驗條件下,不同濃度的蔗糖對酯化酶活性影響結(jié)果如圖2B所示,當(dāng)蔗糖含量為6%時,酯化酶活性達(dá)到292.35 U/mL。

圖2 碳源對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.3 無機(jī)鹽對酯化酶活性的影響 無機(jī)鹽對酯化酶活性的影響,實驗結(jié)果如圖3A所示,其中無水氯化鈣和七水硫酸鎂對酯化酶分泌起促進(jìn)作用,酶產(chǎn)量分別為311.31、287.22 U/mL,而硫酸亞鐵和硫酸鋅對酯化酶的分泌起抑制作用。同時選取無水氯化鈣和七水硫酸鎂進(jìn)行較優(yōu)濃度實驗,結(jié)果如圖3B所示,0.15%的七水硫酸鎂酯化酶活性為298.48 U/mL,0.2%的無水氯化鈣酯化酶活性為322.04 U/mL。

圖3 無機(jī)鹽對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.4 初始pH對酯化酶活性的影響 不同初始pH對酯化酶活性影響結(jié)果如圖4所示。不同起始pH對酯化酶活性影響的差異較大。當(dāng)發(fā)酵液初始pH為4.5時,酯化酶活性最大,為356 U/mL。因此,本研究選擇發(fā)酵液初始pH為4.5進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖4 不同pH對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

經(jīng)上述發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化實驗,得到FBKL3.0018發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)條件為2%牛肉膏+0.3% 硝酸鈉、6%蔗糖、0.15%七水硫酸鎂、0.2%無水氯化鈣、發(fā)酵液初始pH4.5,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行FBKL3.0018發(fā)酵培養(yǎng)條件對酯化酶活性的影響實驗。

隨后，外交部發(fā)言人12月6日在例行記者會上強(qiáng)調(diào)，中方已就此事分別向加方、美方提出嚴(yán)正交涉，并表明嚴(yán)正立場，要求對方立即對拘押理由作出澄清，立即釋放被拘押人員，切實保障當(dāng)事人的合法、正當(dāng)權(quán)益。

2.1.5 發(fā)酵溫度對酯化酶活性的影響 實驗結(jié)果如圖5所示,FBKL3.0018在不同溫度下酯化酶活性各異。酯化酶活性隨溫度升高先增加后降低。當(dāng)發(fā)酵發(fā)酵溫度為31 ℃時，酯化酶活性最大為347.66 U/mL。

圖5 發(fā)酵溫度對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.6 接種量對酯化酶活性的影響 不同接種量對酯化酶活性的影響結(jié)果如圖6所示。酯化酶活性隨接種量增加先增加后降低,當(dāng)接種量為9%(v/w)時達(dá)到最大,酶活為363 U/mL。

圖6 接種量對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.7 溶氧量對酯化酶活性的影響 溶氧量是指水體中氧氣的溶解量,水生生物利用溶解在水中的氧氣來維持生命。在微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)基中溶氧量對代謝物會造成一定影響。溶氧量對酯化酶活性影響結(jié)果如圖7A所示,當(dāng)裝液量為45 mL/250 mL時，達(dá)到最大酶活為338.05 U/mL;而搖床轉(zhuǎn)速對酯化酶分泌的影響結(jié)果如圖7B所示,當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時,酯化酶活性最大為309.05 U/mL。

圖7 溶氧量對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

2.1.8 發(fā)酵時間對酯化酶活性的影響 不同發(fā)酵時間對酯化酶活性的影響結(jié)果如圖8所示,發(fā)酵初期,酯化酶活性隨時間呈線性增加,到96 h時達(dá)最大,酶活為368.69 U/mL。

圖8 發(fā)酵時間對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的影響

通過對FBKL3.0018發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化實驗,得到該菌產(chǎn)酯化酶的單因素優(yōu)化結(jié)果為2%牛肉膏+0.3%硝酸鈉,6%蔗糖,0.2%無水氯化鈣和0.15%七水硫酸鎂,初始pH4.5,發(fā)酵溫度31 ℃,搖床轉(zhuǎn)數(shù)160 r/min,裝液量45 mL/250 mL,接種量9%,發(fā)酵時間96 h。

2.2 Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

Plackett-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果見表3,各因素主效應(yīng)分析見表4。

表3 Plackeet-Burman實驗設(shè)計及結(jié)果

由表4知,在95%水平以上(p<0.05)的影響因素有:發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、蔗糖,所以本實驗選取這三個差異顯著的因素進(jìn)行下一階段的響應(yīng)面試驗。

表4 Plackeet-Burman實驗因素主效應(yīng)分析

2.3 FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及回歸模型方差分析 在Plackett-Burman實驗設(shè)計和主效應(yīng)分析的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計,實驗設(shè)計和結(jié)果見表5,進(jìn)行三因素三水平實驗。

表5 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果

利用中心組合實驗設(shè)計,用Design-Expert 8.06軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,得到FBKL3.0018所產(chǎn)酯化酶對發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、蔗糖(C)擬合回歸方程為:

Y=368.20+7.75A+10.88B+20.13C-5.50AB-14.00AC+12.75BC-67.23A2-49.98B2-48.47C2。

對回歸模型進(jìn)行方差分析,由表6知模型p<0.001,失擬項p>0.05,回歸模型極顯著,失擬檢驗不顯著,表明該模型在所研究區(qū)域內(nèi)擬合性較好。模型R2=0.9915,RAdj=0.9806這兩個值高且接近,表明回歸模型能解釋生產(chǎn)酯化酶的培養(yǎng)優(yōu)化過程,所以方程擬合較好;CV/%<10,證明實驗可信度強(qiáng)及精確度較高。綜上說明該回歸方程給FBKL3.0018生產(chǎn)酯化酶提供了一個良好的模型。

表6 回歸方程的方差分析

回歸方程分析表明,因素B、C、AC、A2、B2、C2對酯化酶的分泌有極顯著的影響(p<0.01),因素A、BC對酯化酶的產(chǎn)生具有顯著影響(p<0.05),因素AB對酯化酶的形成影響不顯著(p>0.05)。此模型中蔗糖和發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間和蔗糖之間交互作用顯著,交互作用如圖10、圖11所示。由F值大小得出，各因素對酯化酶分泌的影響依次是C(蔗糖)>B(發(fā)酵時間)>A(發(fā)酵溫度)。

2.3.2 響應(yīng)曲面和等高線圖及其分析 等高線的形狀為橢圓形表明因素間的交互作用顯著,圓形則表示因素間交互作用不顯著[17]。從圖9的等高線可直觀看出,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用不顯著。從三維立體圖可以看出紅曲霉產(chǎn)酯化酶存在極大點,發(fā)酵溫度從27 ℃升高至31 ℃時,酯化酶產(chǎn)量增加,當(dāng)發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時,酯化酶產(chǎn)量下降,說明酯化酶產(chǎn)量的極點出現(xiàn)在31 ℃左右。因兩者交互作用不顯著,發(fā)酵時間應(yīng)保持在90 h左右。

圖9 發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的交互影響

從圖10的等高線圖可以看出,在發(fā)酵時間穩(wěn)定的情況下,蔗糖和發(fā)酵溫度交互作用顯著,從三維立體圖中可以看出,酯化酶產(chǎn)量在合適的蔗糖濃度和發(fā)酵溫度下,具有最大值,該極大值出現(xiàn)在中間的蔗糖濃度6.5%左右,發(fā)酵溫度31 ℃左右。

圖10 發(fā)酵溫度和蔗糖對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的交互影響

從圖11的等高線圖可以看出,發(fā)酵溫度不變的條件下,發(fā)酵時間和蔗糖交互作用顯著。三維立體圖可以看出,增大發(fā)酵時間和蔗糖有助于提高酯化酶產(chǎn)量,酯化酶產(chǎn)量存在極大點。該極點出現(xiàn)在發(fā)酵時間95 h左右,蔗糖濃度6.5%左右。

圖11 發(fā)酵時間和蔗糖對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的交互影響

2.3.3 回歸模型驗證實驗 通過響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計,經(jīng)Design-Expert軟件分析,得出最優(yōu)條件為30.6 ℃、發(fā)酵時間95.5 h和蔗糖濃度6.2%,預(yù)測值為368.82 U/mL。為滿足實驗實際情況需要,將上述條件改為:發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時間96 h和蔗糖濃度6%進(jìn)行響應(yīng)面所建模型的預(yù)測值驗證實驗,以優(yōu)化后的條件三次重復(fù)實驗,三次實驗結(jié)果均值為355.62 U/mL,SD值為0.78 U/mL,與預(yù)測值368.82 U/mL較接近,相對誤差為0.96%。表明預(yù)測值與實際值具擬合性較好,優(yōu)化模型有效可靠。同時,優(yōu)化后的酯化酶活性(355.62 U/mL)比優(yōu)化前(133.12 U/mL)提高了2.67倍,說明本實驗設(shè)計的優(yōu)化方案合理,得到的培養(yǎng)條件能有效提高酯化酶活性。

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Plackett-Burman實驗設(shè)計,利用響應(yīng)面對FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立產(chǎn)酯化酶的回歸模型,經(jīng)驗證實驗證明該模型切實可行。確定FBKL3.0018產(chǎn)酯化酶的最佳培養(yǎng)條件方為:牛肉膏2%、蔗糖6%、0.2%無水氯化鈣和0.15%七水硫酸鎂、初始pH4.5、發(fā)酵溫度31 ℃、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min、裝液量45 mL/250 mL、接種量9%和發(fā)酵時間96 h。在此條件下,酯化酶活性為355.62 U/mL,比優(yōu)化前提高了2.67倍。