TLRs受體家族及TLR4受體的功能研究

孔維歡，王晶晶，代蓉，萬鵬程，石國慶

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，石河子 832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000）

0 引言

TLR4（Toll like receptor 4）是最早發(fā)現(xiàn)于人類細(xì)胞表面[1]的一種與果蠅Toll蛋白同源的Toll樣受體蛋白，也是繼Nusslein-Volhard等[2]研究出決定果蠅胚胎背、腹側(cè)分化發(fā)育有關(guān)的Toll基因受體家族的成員之一[3]。所有的TLRs同源分子都有著相似的結(jié)構(gòu)，屬于Ⅰ型跨膜蛋白受體，可特異性的識別對應(yīng)的病原相關(guān)分子模式[4]（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），并在1996年Hoffmann小組克隆出果蠅的Toll受體得以證實(shí)有識別并抑制真菌繁殖的能力[5]。最初以為這類天然性的免疫受體只局限于淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、輔佐細(xì)胞等免疫細(xì)胞上的表達(dá)，然而隨著研究領(lǐng)域的不斷深入，免疫細(xì)胞能夠通過PAMP模式對不同的病原微生物及其他抗原類大分子進(jìn)行識別、結(jié)合，并誘發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能進(jìn)而促進(jìn)各種免疫因子和激素的釋放，最終建立起獲得性免疫系統(tǒng)。因此，近年來的研究認(rèn)為營養(yǎng)性肥胖[6]、動脈粥樣硬化、心肌梗死、哮喘等疾病所引起的非細(xì)菌性炎癥反應(yīng)以及部分癌癥瘤細(xì)胞等都與TLR4有關(guān)或者都有TLRs表達(dá)。同時(shí)，TLRs在人和其他哺乳類動物的生殖免疫方面也發(fā)揮著重要的作用，但作用機(jī)制并不十分明確。

1 TLRs受體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

自從Janeway和Lemaitre等人最早發(fā)現(xiàn)與果蠅Toll蛋白同源的人類Toll蛋白及編碼的TLR4受體之后，人們相繼在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了13種TLRs[7]以及確定人類及其他哺乳類動物體內(nèi)有10種TLR[8-10]。TLR作為一種I型跨膜蛋白，它是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)3部分構(gòu)成，其中胞外含有15～29個(gè)亮氨酸重復(fù)序列（LRR）組成以輔助識別病原體微生物及其產(chǎn)物，也可與CD14分子中的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)合而介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用。胞內(nèi)由一段與IL-1受體胞內(nèi)區(qū)的保守序列具有高度同源性的TIR結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成[11]，并且TIR含有的3個(gè)高度保守區(qū)能夠在TLRs和信號傳導(dǎo)銜接蛋白的蛋白質(zhì)中發(fā)揮著重要的作用[12]。不同的TLRs可使用不同的銜接蛋白來確定下游的信號傳導(dǎo)通路，TIR結(jié)構(gòu)中有MyD88、TRIF相關(guān)銜接蛋白、含TIR結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白、誘導(dǎo)IFN-β的含結(jié)構(gòu)域的銜接蛋白和含sterilea與HEAT-Arma dillo基序的銜接蛋白等5種銜接蛋白。而TLR4恰好是至今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)可以使用這5種銜接蛋白的Toll樣受體家族成員[13]。

20世紀(jì)90年代后期，越來越多的TLRs受體家族的受體基因及其配體被發(fā)掘以來，科學(xué)家們對天然免疫的的認(rèn)知逐漸由一種非特異性免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂刑禺愋缘膽?yīng)答反應(yīng)。TLRs分布十分廣泛，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等天然免疫細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的表面，是架接非特異性免疫和特異性免疫的重要橋梁[14]，尤其體現(xiàn)在TLRs胞內(nèi)區(qū)保守的TIR結(jié)構(gòu)域。當(dāng)TLRs通過PAMPs模式識別不同的病原大分子后，其特異性反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)就取決于TLRs的TIR功能域與下游接頭分子的TIR功能域是否能夠發(fā)生特異性相互作用，例如其結(jié)構(gòu)功能域特異募集的下游接頭分子MyD88/TRIF相關(guān)銜接蛋白就是信號通路活化的關(guān)鍵步驟。

TLRs受體家族有MyD88依賴型TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MyD88非依賴型／TRIF依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，顯然在這2種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式中MyD88是一個(gè)關(guān)鍵的接頭蛋白，且在大多數(shù)TLRs信號傳導(dǎo)中有著重要的作用。例如：在TLR2、TLR5、TLR7、TLR9[15]信號傳導(dǎo)途徑中，若有MyD88銜接蛋白的缺陷就會導(dǎo)致信號傳導(dǎo)受阻。而TLR3和TLR4是2個(gè)比較特殊的Toll樣受體，TLR3主要介導(dǎo)MyD88非依賴型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，當(dāng)然MyD88也可以在TLR3的負(fù)調(diào)節(jié)中發(fā)揮功能[16]，TLR4則可以同時(shí)介導(dǎo)這2種傳導(dǎo)途徑（如圖1）。2種不同的信號傳導(dǎo)途徑通過不同的通路，分別經(jīng)過一系列的信號傳導(dǎo)鏈激活NF-kB，AP-1或IRF-3等轉(zhuǎn)錄因子，最后進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)炎癥因子、細(xì)胞因子、共刺激分子和細(xì)胞增殖、凋亡等基因的表達(dá)，從而啟動先天性免疫和獲得性免疫系統(tǒng)[17]。

圖1 TLRs的信號通路傳導(dǎo)示意

2 TLRs的配體識別功能

TLRs有外源性和內(nèi)源性2種配體，外源性配體主要為LPS（革蘭氏陰性菌脂多糖成分）、肽聚糖以及多種細(xì)菌和病毒的核酸等病原微生物類物質(zhì)。不同的PAMP可被不同組合類型的TLR識別，如定位于細(xì)胞膜上的TLR1、TLR2、TLR4-6受體能夠識別病原體的脂肽、多糖、鞭毛和脂蛋白等；定位于細(xì)胞內(nèi)室質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的TLR3、TLR7-9則能識別病原體雙鏈RNA、單鏈RNA、病毒單鏈RNA和DNA。而內(nèi)源性配體則主要是在機(jī)體應(yīng)激或者組織損傷時(shí)，宿主細(xì)胞所釋放的熱休克蛋白和胞外基質(zhì)的降解成分。

當(dāng)然，不同受體與配體之間的結(jié)合并不是固定不變的，它們之間或多或少也有著必然的協(xié)作調(diào)控關(guān)系。例如，在人類免疫應(yīng)答過程中TLR1、TLR2、TLR6主要參與識別分枝桿菌和革蘭氏陽性菌，但有些PAMPs模式的識別只需TLR2參與，如脂磷壁酸。另外，TLR2和TLR1、TLR6又有相互協(xié)作的關(guān)系[18]。譬如，①配體與TLR2結(jié)合可誘發(fā)TNF-α的產(chǎn)生，但是誘發(fā)反應(yīng)又會受到TLR6的抑制。②TLR6與TLR2因表達(dá)形成的異二聚體結(jié)構(gòu)對TLR2的各種配體能夠進(jìn)行模式識別激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)而產(chǎn)生的細(xì)胞因子能夠使TLR2的識別更加廣泛，同時(shí)也增強(qiáng)了TLR2所介導(dǎo)的反應(yīng)。此外，因TLR6和TLR1在結(jié)構(gòu)上有著高度的同源性，所以在某些情況下能夠補(bǔ)償TLR1功能上的不足之處[19]。TLR4除了能夠識別LPS等微生物來源的外源性配體外，還有許多其他配體：分支桿菌的表面抗原、脂質(zhì)體A類似物、呼吸道合胞病毒融合蛋白和熱休克蛋白、纖連蛋白等內(nèi)源性蛋白[20]。有病毒中的相關(guān)研究表明，TLR7和TLR8是TLR9的亞家族成員，在結(jié)構(gòu)上有著高度的同源性。其中TLR7和TLR8識別的單股負(fù)鏈RNA病毒是鼠類中該受體的主要生理配體；TLR9則是識別未甲基化的CpG DNA，與之結(jié)合激活樹突細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子IL-12，從而誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)[21]。TLRs受體家族的其它成員，如TLR10-13等配體識別與作用尚不明確，也未發(fā)現(xiàn)與其結(jié)合的特異性抗體。

3 TLR4受體功能的研究進(jìn)展

TLR4是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)于人類細(xì)胞表面的TLRs受體蛋白，也是TLRs家族中最復(fù)雜，研究領(lǐng)域最為廣泛的成員，幾乎分布于所有的細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)于各種組織細(xì)胞。由于有著特殊的識別結(jié)構(gòu)和My D88依賴/非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使得TLR4不僅有著天然的免疫反應(yīng)，還與腫瘤癌癥發(fā)生機(jī)制和胚胎發(fā)育、妊娠疾病等方面有著直接或間接的關(guān)系，并發(fā)揮著不同程度的作用。

3.1 TLR4受體在腫瘤生長中的作用

近年來研究表明，慢性炎癥是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素[22]，超過l5%的惡性腫瘤與慢性炎癥有著直接的關(guān)系。而且最初認(rèn)為的TLRs只表達(dá)于免疫細(xì)胞是有局限性的，現(xiàn)在越來越多的科學(xué)數(shù)據(jù)表明絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞能夠表達(dá)不同的TLRs[23]，提示了TLRs在慢性炎癥的致瘤機(jī)制中有著重要的作用。其中TLR4在腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，因而TLR4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制備受關(guān)注[24-26]。

3.1.1 腫瘤細(xì)胞的遷移與浸潤

腫瘤細(xì)胞中活化的TLR4不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，而且還能促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移、浸潤以及血管生成[27]，并且血管生成可以在腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用這一重大發(fā)現(xiàn)已被證實(shí)[28]。另外，腫瘤細(xì)胞中受體蛋白的激活誘導(dǎo)了促炎癥細(xì)胞因子和免疫抑制分子的產(chǎn)生，為腫瘤細(xì)胞抵抗細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的攻擊起到了協(xié)同作用，導(dǎo)致了腫瘤的免疫逃逸。但其促腫瘤的明確機(jī)制尚不完全清楚[29]。

TLR4能識別不同的PAMP外源性分子和DAMP內(nèi)源性分子（損傷相關(guān)分子模式）并與之結(jié)合，從而激活TLR4信號傳導(dǎo)通路。兩條不同的依賴/非依賴性途徑最終活化了NF-kB和MAPK通路，誘導(dǎo)了前炎性分子的表達(dá)和I型干擾素及干擾素相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，IFN-10、GARG-16、INF-1的表達(dá)和樹突狀細(xì)胞（DC） 的成熟[30]，從而促進(jìn)抗病毒和抗細(xì)菌免疫。故此，NF-kB的激活能夠直接促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，是慢性炎癥致瘤的重要因素。例如在消化系統(tǒng)腫瘤中，TLR4能夠在胃癌組織以及胃上皮細(xì)胞或者形態(tài)異常的組織中表達(dá)異常升高活化NF-kB[31]，進(jìn)而炎性因子COX-2、PGE2（前列腺素E2）的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，最終導(dǎo)致正常的胃上皮細(xì)胞發(fā)生癌變。同樣的，與人和小鼠慢性結(jié)腸炎有關(guān)的結(jié)腸腫瘤組織也有TLR4的高表達(dá)，并且體內(nèi)外相關(guān)實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)TLR4在炎性相關(guān)的結(jié)腸癌生成中發(fā)揮了作用。這也說明了TLR4對結(jié)腸癌的促進(jìn)作用依賴于COX-2、PGE2的表達(dá)及EGFR （表皮生長因子受體）信號的活化[32]。

3.1.2 腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡

腫瘤生長是細(xì)胞增殖和凋亡之間動態(tài)平衡的一個(gè)調(diào)控過程，LPS等配體使得TLR4信號通路激活后活化了NF-kB，分泌出一些抗凋亡因子和蛋白，如Bcl-2家族蛋白、凋亡抑制因子-1等，并參與腫瘤的生長，形成對腫瘤產(chǎn)生凋亡抵抗的免疫反應(yīng)[33]。例如，臨床醫(yī)學(xué)中常見的腫瘤切除手術(shù)后的繼發(fā)性瘤細(xì)胞生長迅速擴(kuò)散現(xiàn)象，其原因可能是：手術(shù)時(shí)空氣中或者腸道內(nèi)的LPS、細(xì)菌內(nèi)毒素等大分子進(jìn)入腹腔和循環(huán)系統(tǒng)導(dǎo)致了免疫狀態(tài)的改變，從而通過調(diào)控增殖、凋亡平衡以及上調(diào)等相關(guān)因子促進(jìn)了轉(zhuǎn)移灶內(nèi)癌細(xì)胞的生長[34-35]。在慢性炎癥為特征的腫瘤微環(huán)境內(nèi)，癌細(xì)胞中信號的激活促進(jìn)了細(xì)胞的生長和遷移。如：前列腺癌細(xì)胞組成性表達(dá)TLR4，LPS刺激能上調(diào)免疫抑制因子TGF-β1，促進(jìn)腫瘤的免疫逃避，同時(shí)增加促血管生成因子VEGF的分泌，促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖及轉(zhuǎn)移；在膀胱癌中，TLR4信號激活后分泌IL-6，促進(jìn)了腫瘤的進(jìn)化；肺癌細(xì)胞中TLR4信號激活后能抵抗TNF-α 或TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[36-38]。另外，癌細(xì)胞中TLR4信號激活后，通過分泌粘附因子整合素Integrin-β1等促進(jìn)了癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，進(jìn)而分泌蛋白水解酶降解基質(zhì)和基底膜，使得癌細(xì)胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移都與腫瘤微環(huán)境內(nèi)腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、DAMPs以及PAMPs的相互作用有關(guān)，同時(shí)也充分說明TLR4與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移和細(xì)胞調(diào)亡有直接或間接的關(guān)系。但其具體機(jī)制復(fù)雜多樣，尚未完全明了。

3.2 TLR4受體在生殖免疫中的作用

雌性哺乳動物生殖道是一個(gè)與外界環(huán)境相通的開放系統(tǒng)，有著特殊性。其能夠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)是生殖器官及組織抵抗細(xì)菌、病毒、真菌等病原微生物的第一道防線，對免疫機(jī)制有著獨(dú)特而嚴(yán)格的要求，并且受各種內(nèi)分泌激素尤其是性激素的影響十分顯著。例如，子宮就是受雌激素、孕激素影響的典型器官，在妊娠期間由于受體內(nèi)高水平孕激素的影響子宮內(nèi)膜生理結(jié)構(gòu)變得更加疏松，像肥沃的土壤一樣給胚胎提供了適宜的滋養(yǎng)生長條件。

3.2.1 TLR4受體在子宮中的表達(dá)

目前越來越多的國內(nèi)外學(xué)者對雌性哺乳動物生殖免疫產(chǎn)生了興趣。雌性生殖道—子宮通過免疫機(jī)制阻止病原微生物的入侵，從而維持了其正常的生殖機(jī)能。在天然免疫受體中TLR4在機(jī)體天然免疫對病原微生物的識別方面發(fā)揮著非常重要的作用，也是TLRs家族中研究最為廣泛的受體。TLR4活化后將誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)而發(fā)揮強(qiáng)有力的炎癥反應(yīng)，也是架接先天性免疫和獲得性免疫的重要橋梁。因此，TLR4可作為一種重要的免疫因子，參與子宮內(nèi)膜的局部免疫調(diào)節(jié)。在Pioli、 Nishmura等人[39-40]相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)人類的卵巢，輸卵管以及子宮中檢測到了TLR1-10的表達(dá)，并呈現(xiàn)差異性。另外，用熒光定量RTPCR方法也發(fā)現(xiàn)了妊娠老鼠子宮、子宮頸、胎盤等生殖組織中TLRs mRNA的表達(dá)成規(guī)律性變化。同樣，2009年張高英[41]研究發(fā)現(xiàn)TLR4在不同時(shí)期母豬子宮中有差異性表達(dá)，且主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞，提示子宮免疫系統(tǒng)中的免疫因子隨生理、病理狀態(tài)發(fā)生變化。

3.2.2 TLR4受體在子宮內(nèi)膜中的調(diào)控

在雌性哺乳動物健康生殖周期中，子宮中的TLR4也會被無菌炎癥所激活[42]。因此，TLR4在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)可能意味著在生殖周期中出現(xiàn)了無菌性炎癥。通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，在卵泡期和黃體期，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞TLR4的表達(dá)要比表皮細(xì)胞更加強(qiáng)烈[43]。同樣，在人體基質(zhì)細(xì)胞中TLR4的表達(dá)比表皮細(xì)胞更加強(qiáng)烈。TLR4通過PAMP機(jī)制模式識別LPS涉及到CD14 、MD2兩個(gè)配基結(jié)合元件輔助性蛋白分子。其中，已被證實(shí)CD14能夠表達(dá)于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的上皮，而在內(nèi)膜上皮細(xì)胞不表達(dá)。Hirata等還發(fā)現(xiàn)TLR4在膀胱和腸道上皮細(xì)胞中能夠被激活并表達(dá)，并且還抑制了大多數(shù)病原微生物引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步夯實(shí)了除非加入可溶性CD14，TLR4在上皮細(xì)胞中才可能識別LPS?；|(zhì)細(xì)胞中本含有可以識別LPS的膜狀CD14，若缺少膜狀CD14，可能會防止上皮細(xì)胞對病原體產(chǎn)生過度免疫反應(yīng)。相反，在上皮細(xì)胞屏障被突破時(shí)，基質(zhì)細(xì)胞能立即作出反應(yīng)[43]。因此TLR4在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)比上皮細(xì)胞中活躍，這與TLR4，CD14和MD2的mRNA在上皮細(xì)胞中的表達(dá)量比基質(zhì)細(xì)胞低的結(jié)論是一致的。然而在?？苿游锏淖訉m內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中均有CD14蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果作為CD14 mRNA表達(dá)的補(bǔ)充顯示出了物種的差異性[44]。

目前，隨著生殖內(nèi)分泌免疫調(diào)控學(xué)的發(fā)展，激素與免疫系統(tǒng)之間的相互調(diào)節(jié)、相互影響的作用機(jī)制成了研究熱點(diǎn)。子宮作為機(jī)體與直接外界環(huán)境相通的生殖器官，其免疫系統(tǒng)有著獨(dú)特而嚴(yán)格的特殊性，同時(shí)具有一套防御感染的局部免疫機(jī)制。子宮既能發(fā)揮局部免疫反應(yīng)抵抗病原微生物感染，又能對胎兒產(chǎn)生免疫耐受，從而提高了胚胎著床率并保證了妊娠期內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。

4 結(jié)束語

TLR4受體及其家族成員都有著不同的配體分子，參與天然的免疫反應(yīng)，能夠通過本身具有的特殊結(jié)構(gòu)域識別各自的配體引起一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，釋放各種免疫介質(zhì)，進(jìn)而建立起獲得性免疫系統(tǒng)。目前，TLR4在豬、牛、羊、小鼠以及人類等都有廣泛的研究，尤其是在臨床醫(yī)學(xué)和生殖免疫學(xué)方面。TLR4不僅能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移與浸潤、增殖與凋亡，還能促進(jìn)血管的生成。在生殖組織器官中更有差異性的表達(dá)。故此認(rèn)為，TLR4受體可能在哺乳動物胚胎期和個(gè)體生長發(fā)育過程中發(fā)揮一定的作用，經(jīng)前期課題研究發(fā)現(xiàn)TLR4在綿羊胚胎附植期子宮內(nèi)明顯有差異性表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)免疫陽性反應(yīng)。

隨著區(qū)域性經(jīng)濟(jì)發(fā)展，新疆的畜牧業(yè)規(guī)模發(fā)展越發(fā)成熟，對牧民的生活質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)收入提供了可靠的保障來源，也對整個(gè)畜牧業(yè)的發(fā)展起到了促進(jìn)作用。為了能更好的發(fā)展反芻動物的生產(chǎn)量滿足國內(nèi)市場需求，我們可以把TLR4做為妊娠繁殖過程中的候選基因，深入研究TLR4基因在胚胎附植方面的調(diào)控機(jī)制，以提高胎兒著床發(fā)育成功率乃至出生的成活率。從而能夠在生產(chǎn)實(shí)踐中得到推廣和應(yīng)用。