大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞原代細(xì)胞制備及純化的方法改進(jìn)

陳巧紅，盛楠，孫靜，馮波,3，胡格

（1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2.北京動(dòng)物園，北京 100044；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，北京 100193）

0 引言

微血管內(nèi)皮細(xì)胞（microvascular endothelial cells，MVECs） 不僅可以完成基本的血液和組織液的代謝交換，并且可以合成和分泌多種細(xì)胞因子，發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[1]。微血管內(nèi)皮細(xì)胞呈單層覆蓋于微血管內(nèi)表面，是構(gòu)成血管內(nèi)外物質(zhì)交換的一道重要屏障，也是循環(huán)血流剪切力和血液中危險(xiǎn)因素的主要靶細(xì)胞，因而最易并且最早受到傷害[2]。內(nèi)皮細(xì)胞既是細(xì)胞因子作用的靶細(xì)胞又是細(xì)胞因子的重要來(lái)源，其分泌的細(xì)胞因子有集落刺激因子（GM-CSF、G-CSF）、炎癥介質(zhì)（IL-1、1L-6、IL-8、TNF-a）、血小板生成素等[3]。MVECs是抗原呈遞細(xì)胞的一種，在一定條件下能夠顯著性地表達(dá)組織相容性復(fù)合體Ⅱ（MHCⅡ）類分子，以MHCⅡ類分子限制性方式將抗原肽呈遞給淋巴細(xì)胞，促進(jìn)免疫應(yīng)答的進(jìn)程[4]，參與炎癥反應(yīng)。近年來(lái)，內(nèi)皮細(xì)胞在調(diào)節(jié)微循環(huán)、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等方面的功能成為研究熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有功能多樣性，它不僅是構(gòu)成血管組織間屏障的重要成分，而且在調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能[5]，保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，維持正常生理和免疫功能以及介導(dǎo)疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸[6]等方面都發(fā)揮著重要的作用。

體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，登革熱病毒、漢坦病毒、巨細(xì)胞病毒、埃博拉病毒、H5N1亞型禽流感病毒和H9N2亞型禽流感病毒等均可以感染血管內(nèi)皮細(xì)胞。有研究表明，H5N1亞型禽流感病毒可以在血管內(nèi)皮細(xì)胞系和人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）內(nèi)復(fù)制[7]。J.R.Teijaro等[8]研究人員發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要來(lái)源并參與感染過(guò)程。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，H5N1亞型禽流感病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（IFN），啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答[9]。研究人員報(bào)道，H5N1亞型高致病性禽流感病毒能誘導(dǎo)人PMVECs細(xì)胞凋亡[10]。因此，研究PMVECs 在流感病毒感染狀態(tài)下的變化，對(duì)于理解血管內(nèi)皮細(xì)胞在疾病發(fā)生、發(fā)展中所起到的作用非常重要。如何簡(jiǎn)單易行地制備出高純度高質(zhì)量的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，成為對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞研究的敲門(mén)磚。經(jīng)過(guò)多次實(shí)際操作，查閱文獻(xiàn)，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)現(xiàn)有大鼠肺微血管內(nèi)皮原代細(xì)胞的制備及純化過(guò)程做出了切實(shí)有效的改進(jìn)，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

5－7 日齡SD大鼠，購(gòu)自北京興隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖廠。

1.2 主要儀器與器材

37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)為MCO-17AC），由日本SANYO公司生產(chǎn)，倒置熒光顯微鏡（型號(hào)為IX71-A21PH），由OLYMPUS公司生產(chǎn)，普通倒置顯微鏡，高速低溫離心機(jī)（SIGMA 6-16K），細(xì)胞培養(yǎng)板（Costar公司，型號(hào)：3516）超菌工作臺(tái)（型號(hào)為DL-CF-IND），由哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑

hank’s粉末，由sigma公司生產(chǎn)，貨號(hào)為：SLBT7941；胎牛血清，由Gibco公司生產(chǎn)，貨號(hào)為：10099-141；DMEM高糖培養(yǎng)基粉，由Gibco公司生產(chǎn)，貨號(hào)為：1812525；0.25%胰蛋白酶由Gibco公司生產(chǎn)，貨號(hào)為：252000-056；L-谷氨酰胺，由Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：03126；小鼠抗鼠抗體，由BIO-RAD公司生產(chǎn)，批號(hào)：MCA1334G；兔抗大鼠CD31單克隆抗體由Bioss公司生產(chǎn)，批號(hào)：bs-20323R；FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗，由Bioss公司生產(chǎn)，批號(hào)：bs-0295G-FITC；DAPI染色液，由北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：C-0033；ECGS由Millipore公司生產(chǎn)，批號(hào)：02-102。

1.4 細(xì)胞的制備

原代細(xì)胞的制備：取冰盒，裝入2/3的碎冰；6孔細(xì)胞板坐入冰盒內(nèi)，其中4孔每孔加入5 mLD-Hank's液，剩余2孔每孔加入5 mLDMEM培養(yǎng)基；將5日齡大鼠幼鼠仰臥固定在泡沫板上，噴75%乙醇消毒，頸靜脈放血，取肺臟放入4孔D-Hank's中依次清洗后，剪取肺臟邊緣2～3 mm，放在濾紙上滾動(dòng)去除漿膜后依次放入兩孔DMEM中；組織塊放入安瓿瓶中，加入0.5 mL血清，放入冰內(nèi)，用小剪子快速盡可能地剪碎10～20 min；分裝組織塊至6孔板的4孔，在37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)20 min；加入完全培養(yǎng)基1.5 mL/孔，放入恒溫箱培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞的純化（當(dāng)原代細(xì)胞傳至第三代時(shí)開(kāi)始純化過(guò)程）

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)純化法

（1）配液

Buffrer1：Ca2+and Mg2+free PBS supplemented with 0.1% bovine serum albumin（BSA） ，PH 7.4.

Buffrer2：Ca2+and Mg2+free PBS with 0.1% BSA and 0.6% sodium citeate or 2mM EDTA；Note：BSA can be replaced by human serum albumin （HSA） or fetal calf serum （FCS）.

Buffrer3：RPMI 1640 with 1% fetal calf serum（FCS），1mM CaCl2 and 5mM MgCl2，pH 7.0-7.4.

純化后完全培養(yǎng)基（50 mL）：內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)支持物ECGS：規(guī)格15 mg/瓶，使用范圍在10～100 ug/mL ，實(shí)驗(yàn)室用20 ug/mL。加入7.5 mLDMEM 吹勻分裝至EP管，0.5 mL/管（有效量為1 mg）。加入0.5 mLECGS ，0.5 mL 雙抗，0.5 mL L-谷氨酰胺，10 mL 血清，加DMEM定容至50 mL。

（2）純化

以直徑15 cm大皿鋪滿3大皿，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到28的細(xì)胞量為例，介紹加入各個(gè)試劑以及加入的量。

①在1.5 mL離心管內(nèi)加入80 uL磁珠，清洗3遍。（清洗過(guò)程：Buffrer1，D-Hank's，PBS都可以，本次用的是D-Hank's。加入500 uLD-Hank’s，吹打幾次，用強(qiáng)吸力小磁鐵吸珠至底部，小心棄掉上清，為方便吸棄也可將磁珠吸至側(cè)面）。②加入20 uL一抗（原濃度），用小旋轉(zhuǎn)儀旋轉(zhuǎn)1 min后，放在搖床（708）上30 min；消化細(xì)胞，至細(xì)胞呈一個(gè)一個(gè)分離態(tài)，離心；清洗（B1，D-h，P 均可）細(xì)胞一次，再離心，加入700 uL Buffrer1 吹勻。③清洗磁珠2次放于磁鐵上1 min 后棄上清；加入上一步的細(xì)胞懸液并混懸，吹勻換裝至另一個(gè)新的EP管；放于4 ℃ 15 min后，置于搖床（708）10 min。④加入700 uLBuffrer2（量與細(xì)胞懸液同），防止捕捉未結(jié)合磁珠的細(xì)胞，吹勻后可分至兩管便于操作。⑤清洗細(xì)胞2次以上。將上一步的離心管放于磁鐵上從上至下慢慢（2 min）講細(xì)胞吸到底部，小心棄上清，加入700 uL Buffrer1吹打2～3次，吹勻，用同樣方法小心棄上清。⑥預(yù)熱Buffrer3（37 ℃ 10 min以上），在上一步的離心管內(nèi)加入200 uL預(yù)熱好的Buffrer3；加入8 uL重組的釋放緩沖液（DNase1）。⑦室溫孵育15 min。放于搖床（708）15 min；用黃槍頭吹打5～10次并避免起泡；Buffrer3預(yù)處理一個(gè)新的EP管5 min。⑧將原離心管放在磁鐵上2 min ，吸取上清在上一步的EP管內(nèi)；200 uL Buffrer3洗磁珠3次吸取上清收集于上一步的EP管內(nèi)。⑨用明膠（鼠尾膠原）事先潤(rùn)濕12孔板的2孔，將收集的上清轉(zhuǎn)移至潤(rùn)濕的一孔內(nèi)，磁珠加Buffrer3吹勻后轉(zhuǎn)移至另一孔。⑩2 h后換20%加有ECGS的完全培養(yǎng)基。

1.5.2 改進(jìn)純化法

（1）配液

①20%完全培養(yǎng)基（50 mL）：0.5 mL雙抗，0.5 mL L-谷氨酰胺，10 mL血清，加DMEM定容至50 mL。②其它溶液配制不變。

（2）純化

①在1.5 mL離心管內(nèi)加入80 uL磁珠，用Buffrer1清洗三遍。加入500 uL Buffrer1，吹打幾次，用磁力架將磁珠吸至底部，小心棄掉上清液，為方便吸棄也可將磁珠吸至側(cè)面）。②加入20 uL一抗（原濃度），孵育30 min。置于4 ℃，3～5 min手動(dòng)搖晃一次；消化細(xì)胞，至細(xì)胞呈一個(gè)一個(gè)分離態(tài)，離心；清洗（加入Buffrer1吹勻）細(xì)胞一次，再離心；加入700 uL Buffrer1吹勻制成細(xì)胞懸液。③用Buffer1清洗磁珠2次，加入Buffer1吹勻后，放于磁力架上1 min 后棄上清；加入上一步的細(xì)胞懸液并混懸，吹勻換裝至另一個(gè)新的EP管；放于4 ℃ 30 min后，2～3 min手動(dòng)搖晃一次，避免起泡。④加入700 uL Buffrer2（量與細(xì)胞懸液同），防止捕捉未結(jié)合磁珠的細(xì)胞，吹勻后可分至兩管便于操作。⑤用Buffer1清洗細(xì)胞2次以上。將上一步的離心管放于磁鐵上從上至下慢慢（2 min）講細(xì)胞吸到底部，小心棄上清，加入700 uL Buffrer1用黃槍頭吹打2～3次，避免產(chǎn)生氣泡，用同樣方法小心棄上清。⑥預(yù)熱Buffrer3（37 ℃10 min以上），⑦離心管內(nèi)加入200 uL預(yù)熱好的Buffrer3；加入8 uL重組的釋放緩沖液（DNase1）。⑧4 ℃孵育15 min。2～3 min手動(dòng)搖晃一次避免起泡；Buffrer3預(yù)處理一個(gè)新的EP管5min。⑨將原離心管放在磁鐵上2 min ，吸取上清在Buffrer3預(yù)處理過(guò)的一個(gè)新的EP管；200 uL Buffrer3洗磁珠3次吸取上清收集于上一步的EP管內(nèi)。⑩用明膠（鼠尾膠原）事先潤(rùn)濕12孔板的2孔，將收集的上清轉(zhuǎn)移至潤(rùn)濕的一孔內(nèi)，磁珠加Buffrer3吹勻后轉(zhuǎn)移至另一孔。k加入500 uL20%不加ECGS的完全培養(yǎng)基。12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2 改進(jìn)之處

2.1 原代細(xì)胞制備

第一，原代細(xì)胞制備過(guò)程中，在取肺臟時(shí)應(yīng)先找到心臟，用鑷子夾住心肺連接的位置將心臟和肺臟同時(shí)取出，再分離出肺臟。第二，分裝組織塊時(shí)，可用血清將過(guò)多的組織塊吹下，繼續(xù)鋪板。第三，組織塊貼壁60 h棄組織塊改為50 h棄組織塊。

2.2 細(xì)胞純化

第一，原代細(xì)胞傳至第三代即開(kāi)始純化。第二，抗體孵育改室溫為4 ℃。第三，改搖床不間斷搖晃為3～5 min手動(dòng)搖晃一次。第四，孵抗體后吹打過(guò)程均使用黃槍頭，并盡量避免泡產(chǎn)生。第五，重復(fù)進(jìn)行Buffrer3洗磁珠的過(guò)程使細(xì)胞與磁珠分離更加徹底。第六，改純化后2 h加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基，純化后立即加入不含ECGS的20%完全培養(yǎng)基。

3 結(jié)果

通過(guò)多次嘗試與改進(jìn)，對(duì)現(xiàn)有已發(fā)表文獻(xiàn)所用的方法進(jìn)行實(shí)踐與改進(jìn)，之后得到了狀態(tài)良好，可以穩(wěn)定傳代的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，具體結(jié)果見(jiàn)圖片。

3.1 原代細(xì)胞制備圖片

圖1 原代細(xì)胞制備圖片

（1）組織塊貼壁24 h，見(jiàn)A組圖片，A1為4倍鏡下圖片，A2為10倍鏡下圖片，A3為20倍鏡下圖片?？梢詮膱D片中看到內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)開(kāi)始貼壁爬出，在組織塊邊緣可見(jiàn)明顯的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞爬出，并且呈鋪路石樣生長(zhǎng)，形態(tài)，大小均勻。

（2）組織塊貼壁50 h，如B組圖片，為棄掉組織塊之前的圖片，其中B1為4倍鏡下圖片，B2、B3為10倍鏡下圖片。此時(shí)我們可以從圖片中看出，在組織塊邊緣，較24 h時(shí)爬出了較多的內(nèi)皮細(xì)胞，成片生長(zhǎng)，相鄰組織塊旁爬出細(xì)胞基本鋪滿細(xì)胞板，呈鋪路石樣生長(zhǎng)，形態(tài)，大小均勻。

（3）如C組圖片，為棄掉組織塊后的圖片，C1、C2為4倍鏡下圖片，C3為10倍鏡下圖片。加入1%雙抗的hank’s液用移液器輕輕吹凈組織塊，要盡可能的沖洗干凈，防止殘余組織塊繼續(xù)爬出成纖維細(xì)胞，如圖所示在原有組織塊的位置出現(xiàn)明顯的空隙。

（4）圖D，是去組織塊36 h后，可以看出細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好已經(jīng)長(zhǎng)滿棄掉組織塊以后出現(xiàn)的空白區(qū)域，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3.2 純化后細(xì)胞圖片

純化后將解離后的上清和磁珠分別種于48孔板的2孔。

圖2 純化后細(xì)胞圖片

如圖E1是磁珠接種于細(xì)胞板內(nèi)的圖片，E2為純化后目標(biāo)細(xì)胞圖片，從圖片可見(jiàn)由6孔板4板細(xì)胞純化僅僅得到101單位數(shù)目的內(nèi)皮細(xì)胞，純化結(jié)束直接加入20%完全培養(yǎng)基，24 h后換液，96 h可見(jiàn)E3圖片，細(xì)胞基本鋪滿48孔板，長(zhǎng)勢(shì)良好，未見(jiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)變化。E4為第三次傳代后80 h圖片，細(xì)胞鋪排均勻，細(xì)胞狀態(tài)良好，無(wú)抽絲和形態(tài)上的異常變化；E5為免疫熒光鑒定大鼠肺內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果，可見(jiàn)視野范圍內(nèi)未見(jiàn)雜細(xì)胞；E6為傳至第11代的照片，未見(jiàn)形態(tài)變化。

4 結(jié)束語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)以上提到的幾個(gè)方面對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行改進(jìn)，獲得了純度更高的PMVECs，接下來(lái)介紹其主要理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)進(jìn)展過(guò)程。

4.1 原代細(xì)胞的制備

當(dāng)前，RPMVECs的培養(yǎng)方法主要有2種，主要有酶消化法和組織塊法[11]。酶消化法操作過(guò)程復(fù)雜、試劑昂貴，細(xì)胞因活性較低難以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，在國(guó)內(nèi)很少應(yīng)用。組織塊法由于操作簡(jiǎn)單，過(guò)程中無(wú)酶對(duì)細(xì)胞的損傷故活性較高，但該法由于特異性較低，容易受到成纖維細(xì)胞等其它雜細(xì)胞的混雜污染[12]。

（1）原代細(xì)胞制備過(guò)程中，在取肺臟時(shí)應(yīng)先找到心臟，用鑷子夾住心肺連接的位置將心臟和肺臟同時(shí)取出，這樣就能得到完整的肺臟，這樣大大降低了取肺邊緣的難度，也使得肺臟的利用效率大大提高，使得原代細(xì)胞的制備變得更加高效[13]。

（2）分裝組織塊時(shí)，可用血清將過(guò)多的組織塊吹下繼續(xù)貼壁。原因有二，一方面防止因組織塊密度過(guò)大，不利于細(xì)胞的爬出；另一方面增加了鋪板量，提升了組織塊的利用率和細(xì)胞制備的效率；

（3）組織塊貼壁60 h棄組織塊改為50 h棄組織塊，此舉目的是為了減少雜細(xì)胞成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）的數(shù)量，保證目標(biāo)細(xì)胞大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（PMVECs）的數(shù)量。文獻(xiàn)記載和經(jīng)驗(yàn)所得，我們知道微血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h時(shí)開(kāi)始爬出，成纖維細(xì)胞在60 h時(shí)已經(jīng)有部分爬出。因此，50 h棄組織塊減少了成纖維細(xì)胞數(shù)量；同時(shí)，保證了內(nèi)皮細(xì)胞充足的生長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)胞數(shù)量得到了保證，在傳代后足夠的細(xì)胞濃度可以保證細(xì)胞良好的生長(zhǎng)發(fā)育[14]。

4.2 細(xì)胞純化

目前已有的PMVECs的純化方法主要有生物特性選擇法、物理剖除法、局部消化法、差速黏附法及免疫磁珠法[15]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫磁珠純化法純化PMVECs[16]，具有分離速度快、效率高、重復(fù)性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單并且不影響被分離細(xì)胞的生物學(xué)性狀和功能等優(yōu)點(diǎn)[17]。在純化過(guò)程中利用磁珠分選純化系統(tǒng)篩選CD31+細(xì)胞，磁珠釋放液去除CD31+細(xì)胞結(jié)合的磁珠，獲得了高純度的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞[18]。

（1）原代細(xì)胞傳至第三代即開(kāi)始純化。這樣保證了純化所需的細(xì)胞數(shù)量，也保證了CD31的高表達(dá)。免疫磁珠純化法的基本原理是磁珠通過(guò)抗體與內(nèi)皮細(xì)胞特意表達(dá)蛋白CD31的結(jié)合來(lái)完成的，研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞在前三代高表達(dá)CD31，使得純化的結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，在純化時(shí)有較大的細(xì)胞基數(shù)，可以提高細(xì)胞純化的成功幾率。

（2）抗體孵育改室溫為4 ℃。多次實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)純化結(jié)果不理想，細(xì)胞數(shù)量較少，導(dǎo)致最終實(shí)驗(yàn)失敗后，查閱了大量文獻(xiàn)并且閱讀抗體說(shuō)明書(shū)，發(fā)現(xiàn)抗體在4 ℃時(shí)有最高效價(jià)，于是改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，在孵育抗體時(shí)以及后面相關(guān)操作時(shí)均在4 ℃冰箱中進(jìn)行。

（3）改搖床不間斷搖晃為3～5 min手動(dòng)搖晃一次?？捎行П苊馀菽a(chǎn)生，使抗體、試劑充分與磁珠、細(xì)胞接觸。搖床搖晃EP管時(shí)發(fā)現(xiàn)有大量泡沫產(chǎn)生，影響了細(xì)胞、抗體、磁珠的充分接觸，使得純化效率降低；另外手動(dòng)搖晃可以將純化所用的EP管置于4 ℃冰箱中，確保了抗體的最高效價(jià)，提升了純化效率。

（4）孵抗體后吹打過(guò)程均使用黃槍頭，并盡量避免氣泡產(chǎn)生。使用黃槍頭（200 μL）吹打液體，較白槍頭（10μL）吹打徹底，較藍(lán)槍頭（1 000 mL）吹打輕緩，不會(huì)因?yàn)閯×掖荡驅(qū)е屡菽漠a(chǎn)生，影響細(xì)胞、抗體、磁珠及解離液等各物質(zhì)的接觸[17]。

（5）重復(fù)進(jìn)行Buffrer3洗磁珠的過(guò)程使細(xì)胞與磁珠分離更加徹底。在加入解離液DNasa后，磁珠與細(xì)胞分離，為了盡可能將細(xì)胞與磁珠分離，可以多次加入Buffrer3進(jìn)行吹打后置于磁力架上吸取上清。

（6）改純化后2 h加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基，為純化后立即加入不含ECGS的20%完全培養(yǎng)基。在純化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，將上清接種于細(xì)胞板2 h細(xì)胞并沒(méi)有貼壁，此時(shí)吸取上清容易將目標(biāo)細(xì)胞從板中吸出。并且加入培養(yǎng)基中加入含有ECGS的完全培養(yǎng)基后，內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了很大的變化。因此決定不適用ECGS，并且在純化結(jié)束時(shí)立即加入500 μL/孔20%完全培養(yǎng)基24 h后換液，觀察細(xì)胞貼壁良好，狀態(tài)良好。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，細(xì)胞在多次傳代后，細(xì)胞狀態(tài)良好，仍未見(jiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)上的明顯變化，免疫熒光鑒定法結(jié)果表現(xiàn)可見(jiàn)范圍內(nèi)未見(jiàn)雜細(xì)胞，這表明了改進(jìn)方法確實(shí)提高了細(xì)胞制備純化的效率，也提高了純化后細(xì)胞的質(zhì)量。