乳沒活絡散的鑒別和限量檢查研究*

陳思穎 ，田 勇 ，李莉娜 ，3，陸 苑 ，王永林 ，李勇軍 ，王愛民 △

（1.貴州醫(yī)科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室 藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.思南田氏民族傳統(tǒng)骨傷醫(yī)院，貴州 銅仁 565100； 3.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學·民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004）

乳沒活絡散是貴州省思南田氏民族傳統(tǒng)骨傷醫(yī)院根據(jù)具有200多年民間藥用歷史的家傳秘方研制開發(fā)的醫(yī)療機構制劑（黔藥制字Z20170134），具有活血化瘀、舒經(jīng)活絡、消腫止痛的功效，可用于治療閉合性骨折、跌打扭傷及骨傷病變等疾病。該方針對骨折、跌打扭傷“氣滯血瘀證”遣方用藥，由三七、乳香、沒藥、制川烏、制草烏等10味中藥組方，經(jīng)過30余年的臨床使用，療效顯著，深受患者歡迎。本研究中參考相關標準和文獻制訂了乳沒活絡散的顯微鑒別方法，對乳香、蘇木、續(xù)斷進行薄層色譜（TLC）鑒別，對制川烏、制草烏中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿限量進行檢查，以控制乳沒活絡散的質(zhì)量，提高臨床用藥的有效性和安全性?，F(xiàn)報道如下。

圖1 乳沒活絡散顯微鑒別圖

1 儀器與試藥

1.1 儀器

尼康50i顯微鏡和尼康DS－Fi2成像系統(tǒng)（放大倍率為10～1 500倍，日本尼康公司）；TLCACANNER 3型薄層色譜成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司，參數(shù)：230V，50／60Hz，80 VA，UV 254／366 nm 紫外光管，400～750 nm 白光管）；CQ－250A－ST型超聲波清洗機（四川中浪科技有限公司）。

1.2 試藥

乳香對照藥材（批號為120970－201305，規(guī)格為0.5 g），沒藥（天然沒藥）對照藥材（批號為 120967－201405，規(guī)格為1 g），蘇木對照藥材（批號為121067－201606，規(guī)格為1 g），續(xù)斷對照藥材（批號為 121－33－201311，規(guī)格為2 g），均購自中國食品藥品檢定研究院；烏頭堿對照品（批號為150325，規(guī)格為20 mg），次烏頭堿對照品（批號為150811，規(guī)格為20 mg，），新烏頭堿對照品（批號為150913，規(guī)格為20 mg），均購自四川省維克奇生物科技有限公司，上述對照品經(jīng)高效液相色譜（HPLC）法測定含量均不低于98%；三氯甲烷（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20160803，規(guī)格為每瓶0.5 L）等試劑均為分析純；硅膠G和硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠，規(guī)格為100 mm×100 mm）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別[1－5]

參照2015年版《中國藥典（四部）》通則2001“顯微鑒別法”，取乳沒活絡散，按粉末制片法制片后置顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖1。淀粉粒眾多，網(wǎng)紋、梯紋導管，草酸鈣簇晶，木栓細胞長方形或多角形（三七）；不規(guī)則團塊，無色或淡黃色，表面及周圍擴散出眾多細小顆粒（乳香）；不規(guī)則碎塊，淡黃色半透明滲出油滴（沒藥）；石細胞呈長方形或類長方形，直徑40～120μm（制川烏和制草烏）；體壁碎片上有短粗或細長剛毛（土鱉蟲）。

2.2 薄層色譜鑒別

乳香[1，6－10]：取乳沒活絡散 3 g，加無水乙醇 15 mL，超聲處理15 min，濾過，水浴濃縮至2 mL，作為供試品溶液；另取缺乳香的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；再取乳香對照藥材適量，同法處理，制得對照藥材溶液。分別吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10 ∶1.5 ∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 1%的香草醛硫酸溶液（以60%硫酸水溶液作為溶劑），在105℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果斑點清晰，比移（Rf）值適中。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 A。

蘇木[1，9－10]：取乳沒活絡散 1 g，置索式提取器中，加乙醚適量加熱回流除去脂溶性成分，藥渣揮干乙醚，再加甲醇適量，加熱回流提取1 h，甲醇提取液揮干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；另取缺蘇木的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；再取蘇木對照藥材0.5 g，同法處理，制得對照藥材溶液。分別吸取上述供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，對照藥材溶液5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－丙酮 －甲酸（8∶4 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（254 nm）下視檢，室溫放置12 h后日光下再次檢視。結(jié)果室溫放置12 h后色譜斑點顯色清晰，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 B。

續(xù)斷[1，11－13]：取乳沒活絡散 0.5 g，加甲醇適量，超聲處理25 min，濾過，濾液蒸至近干，殘渣加水20 mL使溶解，濾過，濾液加濃氨水5 mL，再加水飽和的正丁醇提取3次，每次15 mL，合并上層溶液，加正丁醇飽和的水洗滌3次，每次15 mL，合并上層溶液，蒸至近干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺蘇木的陰性制劑0.5 g，同法制備陰性對照品溶液，再取續(xù)斷對照藥材0.1 g，同法制成對照藥材溶液。分別吸取對照藥材溶液2μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－醋酸－水（4∶1∶5）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃ 加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖2 C。

圖2 薄層色譜圖

2.3 雙酯型生物堿限量檢查[1，13－14]

生川烏和生草烏中含有以烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿為主的毒性成分雙酯型生物堿，經(jīng)炮制后水解為毒性較低的單酯型生物堿。為控制乳沒活絡散質(zhì)量，本研究中對制劑中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的限量檢查進行了研究。

取乳沒活絡散10 g，加氨試液20 mL拌勻，放置1 h，加三氯甲烷100 mL，加濃氨水4 mL，超聲處理30 min，濾過，殘渣和濾器用適量三氯甲烷洗滌，洗滌液與濾液合并，分取三氯甲烷層，置分液漏斗中，用5% 鹽酸溶液提取3次，每次20 mL，合并上層溶液，用濃氨水調(diào)節(jié)pH至11～12，用三氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并下層溶液，回收至干，殘渣加甲醇溶解成1 mL，作為供試品溶液；取缺制川烏、制草烏的陰性制劑，同法制備陰性對照品溶液；取缺制川烏、制草烏的陰性制劑，分別加入烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品適量，同法制備陰性對照品溶液加混合對照品溶液。再取烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿對照品適量，用0.1%甲酸甲醇溶液溶解，制成 0.48，0.24，0.12 g／L 3種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。分別吸取供試品溶液10μL和3種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷 －乙酸乙酯 －甲醇（3.2∶1.8∶1）為展開劑，置氨蒸氣飽和30 min的展開缸內(nèi)展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，在日光下檢視。結(jié)果陰性對照無干擾，質(zhì)量濃度為0.48，0.24 g／L的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿顯色清晰，質(zhì)量濃度為0.12 g／L的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿顯色不明顯，表明本方法檢測烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿檢出限為1.2μg（0.24 g／L對照品溶液點樣5μL），詳見圖3。

圖3 雙酯型生物堿限量確定薄層色譜圖

吸取上述質(zhì)量濃度為0.24 g／L對照品溶液5μL，供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，同法展開顯色。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上出現(xiàn)的斑點應小于對照品溶液的斑點或不出現(xiàn)斑點，且陰性對照無干擾。詳見圖4。

圖4 雙酯型生物堿限量檢查薄層色譜圖

3 討論

乳香鑒別試驗中，分別以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1.5）、石油醚－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶1）及石油醚（60～90℃）－甲苯 －乙酸乙酯（10∶1.5∶0.5）為展開劑，結(jié)果以石油醚（60～90℃）－甲苯－乙酸乙酯（10∶1.5∶1）為展開劑時展開效果較好，斑點清晰，Rf值適中，故試驗中選用以其為展開劑。

雙酯型生物堿的限量檢查中，發(fā)現(xiàn)烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在甲醇中穩(wěn)定性較差，混合對照品溶液在含0.1%甲酸的甲醇溶液中穩(wěn)定性較好。

乳沒活絡散中制川烏和制草烏占全方的6%，2015年版《中國藥典（一部）》制川烏和制草烏項下規(guī)定，雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的總量計，均不得超過0.04%。因此，10 g制劑中雙酯型生物堿以烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿總量不得超過0.24 mg（10 g×6% ×0.04% ＝0.24 mg，經(jīng)供試品溶液制備后，3種生物堿均為0.24 g／L）。為保證制劑的安全性，供試品中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿在薄層色譜上的斑點不得比0.24 g／L對照品溶液點樣5μL的斑點深（即10 g烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的限量不高于 0.24 mg）。