高效液相色譜法測(cè)定毛黃堇不同部位脫氫卡維丁含量

吳 佳

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，重慶 401121）

毛黃堇 Corydalistomentella Franch.系罌粟科紫堇屬植物，產(chǎn)于湖北西部、四川東部至南部、重慶、陜西南部，又名干巖矸，全草皆可入藥，為民間貴重中草藥[1－2]。其具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和強(qiáng)安定作用，主治瘡癰腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌等癥[3－4]。毛黃堇與石生黃堇?5－6?均含有明確的藥理活性成分脫氫卡維丁，且含量較高[7]。本研究中建立了測(cè)定毛黃堇中脫氫卡維丁含量的高效液相色譜（HPLC）法，考慮毛黃堇為全草入藥，各部位之間的脫氫卡維丁含量可能存在差異[5]，故對(duì)其不同部位葉、葉柄及根莖進(jìn)行了定量分析?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器，Agilent 1260工作站），BP221S型、MSA225S－100－DU 型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ－500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；烘箱（德國(guó)Binder公司）。

1.2 試藥

脫氫卡維丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為111732－200904）；毛黃堇由重慶市藥物種植研究所提供，采集地為南川金佛山，由本院蔣萬(wàn)浪主任中藥師鑒定為正品；乙腈為色譜純，二乙胺、甲醇、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

取五氧化二磷中減壓干燥至恒重的脫氫卡維丁對(duì)照品適量，精密稱定，加1%鹽酸甲醇溶液制成每1 mL含0.200 4 mg的對(duì)照品溶液[8]。取本品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為250 W，頻率為40 kHz）30 min，置室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖溶液（每1 L含20 mmol磷酸二氫鉀，10 mmol二乙胺，0.1%磷酸）－乙腈（72 ∶28）；流速：1 mL ／min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：347 nm；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下，分別進(jìn)樣對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，色譜峰峰形良好，達(dá)到較理想的分離結(jié)果，理論板數(shù)按脫氫卡維丁峰計(jì)算大于4 000，具有較好的專屬性，分析條件可行。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.2，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)（X）和對(duì)應(yīng)峰面積的對(duì)數(shù)（Y）計(jì)算回歸方程，得 Y＝2 833.6 X＋99.236，r＝0.999 1（n＝7），線性范圍為 0.040 08～2.404 80μg。

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.32%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于 0，2，4，8，12 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.9%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的 RSD為1.8%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的毛黃堇（3.028 2 mg／g，未除水分）9份，精密稱定0.1 g，分別精密加入低、中、高濃度的對(duì)照品貯備液，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.4 樣品含量測(cè)定

將毛黃堇全草進(jìn)行部位拆分，分別得葉、葉柄、根及根莖3個(gè)部位，將上述3份樣品置硅膠中干燥48 h，取上述3份樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，同時(shí)按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0832第二法測(cè)定水分。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 脫氫卡維丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

3 討論

曾嘗試用以下2種溶劑制備供試品溶液：1%鹽酸甲醇溶液；流動(dòng)相溶液[磷酸鹽緩沖溶液（每1 L含20 mmol磷酸二氫鉀，10 mmol二乙胺，0.1%磷酸）－乙腈（72∶28）][9]。結(jié)果采用第1種溶劑，有效成分提取更完全，且雜質(zhì)較少。試驗(yàn)了0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液－乙腈的流動(dòng)相系統(tǒng)[10]，但脫氫卡維丁峰對(duì)稱性較差，易拖尾。

經(jīng)過(guò)對(duì)脫氫卡維丁的二極管陣列掃描，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)較大的紫外吸收峰，最強(qiáng)吸收峰在274 nm波長(zhǎng)處[11]，次吸收峰在347 nm波長(zhǎng)處。但采用274 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)雜質(zhì)干擾較多，而選用347 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)干擾較小[12－13]，故最終選用347 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)毛黃堇植物各部位脫氫卡維丁含量的考察發(fā)現(xiàn)，在根及根莖中脫氫卡維丁的含量最高，葉柄次之，葉中含量最低，僅為根及根莖中的1／10。根據(jù)上述試驗(yàn)，不僅掌握了毛黃堇中脫氫卡維丁的含量分布，更為制訂毛黃堇質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及限度提供了參考依據(jù)。HPLC法測(cè)定毛黃堇中脫氫卡維丁含量，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，色譜圖可反映毛黃堇的特征，對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。