天漠嗜鹽和耐鹽細(xì)菌產(chǎn)淀粉酶活性及菌株多樣性*

楊玉婷，吳秋蕾，張 俊，張 麗，賀建武，劉祝祥，陳義光

(吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000)

按照對(duì)鹽分的依賴程度、耐受濃度以及最適生長(zhǎng)濃度的不同，微生物可以分為非嗜鹽微生物、耐鹽微生物和嗜鹽微生物.[1-3]嗜鹽微生物通常是指生活在高鹽環(huán)境(鹽湖、海洋、曬鹽場(chǎng)和鹽堿地等)中的微生物類群，屬于極端微生物.[4]由于獨(dú)特的基因類型和特殊的代謝途徑，嗜鹽和耐鹽菌在食品、化工等方面具有廣闊的應(yīng)用前景.[5-7]

淀粉酶是可以催化淀粉和糖原進(jìn)行水解反應(yīng)并轉(zhuǎn)化成葡萄糖及其他低聚糖的一類酶的總稱.動(dòng)物、植物和微生物都產(chǎn)生淀粉酶，其特征各不同，種類繁多.淀粉酶制劑是目前產(chǎn)量最大、應(yīng)用頗廣的一種酶制劑，主要應(yīng)用于釀造、醫(yī)藥、紡織、食品加工等行業(yè)領(lǐng)域[8-11].淀粉酶自1883年被分離出來(lái)以后，有關(guān)學(xué)者已對(duì)其進(jìn)行了大量的研究，但是對(duì)嗜鹽耐鹽菌產(chǎn)生的淀粉酶活性及菌株系統(tǒng)發(fā)育多樣性的研究較少.為深入研究、保護(hù)和開發(fā)利用該類微生物資源，筆者以分離自張家口天漠沙土中的嗜鹽和耐鹽細(xì)菌(含放線菌，以下簡(jiǎn)稱嗜鹽和耐鹽菌)為研究對(duì)象，采用平板水解圈法(Plate Hydrolysis Spot Method)對(duì)其產(chǎn)生的淀粉酶進(jìn)行活性篩選，并采用16S rRNA基因序列分析法對(duì)陽(yáng)性菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 實(shí)驗(yàn)菌株共76株嗜鹽和耐鹽細(xì)菌(含放線菌)，最低能耐受NaCl質(zhì)量濃度100 g/L，由吉首大學(xué)微生物資源與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室于2017年9月分離自河北省張家口市天漠沙土.

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)MA10培養(yǎng)基：NaCl 100.0 g，MgCl2·6H2O 5.9 g，Na2SO43.2 g，CaCl21.9 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，復(fù)合鹽A液20 mL，復(fù)合鹽B液1 mL，瓊脂20.0 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0.復(fù)合鹽A液:Na2CO38.0 g，KCl 27.5 g,Ferric citrate 5.0 g，H2O 1 L.復(fù)合鹽B液：KBr 80.0 g，H3BO322.0 g，Na2HPO48.0 g,Na2SiO34.0 g，SrCl34.0 g，(NH4)2SO41.6 g，H2O 1 L.(2)淀粉水解培養(yǎng)基：按照MA10培養(yǎng)基配方，加入0.2%可溶性淀粉(先用少量水溶解).

1.1.3 主要試劑與儀器 主要試劑：盧哥氏碘液(按文獻(xiàn)[12]配制)；可溶性淀粉(分析純)；PCR引物、試劑和Taq酶均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司.

主要儀器：生物安全柜(BSC-04IIB2，蘇凈安泰)；恒溫培養(yǎng)箱(IS-RDD3，CRYSTAL)；恒溫震蕩培養(yǎng)箱(IS-RDVL，CRYSTAL)；顯微鏡(AB210-T，Motic)；冷凍干燥儀(HETOLL1500，捷克)；離心機(jī)(Centrifuge-5424，Eppendorf)；PCR擴(kuò)增儀(TC-4000，TECHNE)；凝膠成像儀(1600R，Tanon)；電泳儀(Powerpac-HV，BIO-RAD).

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 從牛奶管中挑取實(shí)驗(yàn)菌株，用MA10培養(yǎng)基平板劃線，28 ℃培養(yǎng)7～10 d.如此活化2次，接種到MA10平板和斜面，備用.

1.2.2 淀粉酶活性篩選 采用平板水解圈法(Plate Hydrolysis Sport Method)[12]進(jìn)行.取活化好的實(shí)驗(yàn)菌株，采用點(diǎn)接法在淀粉水解培養(yǎng)基平板上接種，每個(gè)平板接種4株菌.28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌株生長(zhǎng)情況.在平板上倒盧哥氏碘液至淹沒培養(yǎng)基表面，染色2～3 min，棄碘液.若菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明水解圈，表示淀粉水解酶呈陽(yáng)性.透明水解圈直徑越大，表示菌株產(chǎn)淀粉酶活性越強(qiáng).

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析 細(xì)菌基因組DNA酶法提取和16S rRNA基因PCR擴(kuò)增按文獻(xiàn)[13]所用方法操作.PCR產(chǎn)物由上海生工進(jìn)行測(cè)序，所得序列上傳NCBI(National Center for Biotechnology Information)網(wǎng)站(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的GenBank等序列公共數(shù)據(jù)庫(kù)供共享，并獲得序列號(hào)(Accession Number).在韓國(guó)分類公共數(shù)據(jù)網(wǎng)站EzBioCloud(http:∥www.ezbiocloud.net/identify)用Blast搜索程序進(jìn)行相似性搜索[14]，調(diào)取同源性高的序列建立序列集.相似性(Sequence Similarity)計(jì)算和多重序列比對(duì)用CLUSTAL_X軟件[15]進(jìn)行，系統(tǒng)進(jìn)化距離用Kimura模型[16]估算，聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建運(yùn)用MEGA 6.0軟件包中的鄰接(Neighbor-Joining)[17]法進(jìn)行，重復(fù)1 000次估算進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[18].

1.2.4 生物學(xué)特性觀察 參照文獻(xiàn)[12]中的方法，以MA10為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對(duì)部分產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行菌落特征、顯微特征、生長(zhǎng)條件和生理生化特征等基本生物學(xué)特征進(jìn)行觀察.

2 結(jié)果分析

2.1 淀粉酶活性篩選

根據(jù)平板水解圈法，對(duì)分離自張家口天漠沙土的76株嗜鹽和耐鹽菌進(jìn)行了淀粉水解酶活性篩選，共得到淀粉酶活性菌株34株(表1)，陽(yáng)性率44.7%.

表1 天漠沙土嗜鹽和耐鹽菌淀粉酶活性篩選結(jié)果

在以上陽(yáng)性菌株中，發(fā)現(xiàn)有6株(JSM 1684012，JSM 1684041，JSM 1684067，JSM 1685081，JSM 1685082，JSM 1685098)產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)，其淀粉水解圈直徑大于或等于50 mm，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值(表2).

表2 天漠沙土嗜鹽和耐鹽菌中淀粉酶活性較強(qiáng)菌株水解圈直徑

2.2 基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)34株淀粉酶陽(yáng)性菌進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，所得序列提交GeneBank注冊(cè)并獲取相對(duì)應(yīng)的序列號(hào).基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，這34株淀粉酶產(chǎn)生菌類群多樣性和物種多樣性較高，可以歸為18個(gè)物種，分屬于細(xì)菌域(Bacteria)的2門(Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes)2科(Streptomycetaceae，Bacillaceae)8屬(Streptomyces，Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus)(表3).

表3 天漠沙土嗜鹽和耐鹽菌淀粉酶活性陽(yáng)性菌與其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切的典型菌株

注：*產(chǎn)淀粉酶活性較強(qiáng)菌株.

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，淀粉酶活性較強(qiáng)的6株菌都屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽孢桿菌科(Bacillaceae)，分屬于該科的3個(gè)屬(Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus).其中JSM 1684012，JSM 1684041和JSM 1685098屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，JSM 1684067和JSM 1685082屬于纖長(zhǎng)芽孢桿菌屬(Gracilibacillus)，JSM 1685081屬于喜鹽芽孢桿菌屬(Halobacillus)(表3，圖1).

圖1 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建的6株較強(qiáng)淀粉酶產(chǎn)生菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogenetic Tree of 6 Strains Strong in Starch Hydrolysis Based on 16S rRNA Gene Sequence Analysis

2.3 較強(qiáng)淀粉酶活性菌株的生物學(xué)特征

對(duì)6株淀粉酶活性較強(qiáng)菌株的菌落特征、顯微形態(tài)、生長(zhǎng)條件和部分生理生化特征進(jìn)行觀察，結(jié)果見表4.

表4 分離自天漠沙土的6株淀粉酶活性較強(qiáng)的嗜鹽和耐鹽菌的部分生物學(xué)特征

注:+陽(yáng)性;-陰性；所有菌株H2S產(chǎn)生和酪素及纖維素水解呈陰性.

3 討論

淀粉酶活性篩選表明，分離自河北省張家口市天漠沙土的76株嗜鹽和耐鹽菌中具有較高比例的淀粉酶活性菌株，共34株，陽(yáng)性率44.7%.其中6株(JSM 1684012，JSM 1684041，JSM 1684067，JSM 1685081，JSM 1685082，JSM 1685098)顯示出較高的淀粉酶活性.基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，這34株淀粉酶陽(yáng)性菌株具有較高的類群多樣性和物種多樣性，可以歸為18個(gè)物種，分屬于細(xì)菌域(Bacteria)2門(Actinobacteria，F(xiàn)irmicutes)2科(Streptomycetaceae，Bacillaceae)8屬(Streptomyces，Bacillus，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus).根據(jù)有關(guān)報(bào)道，目前生產(chǎn)與應(yīng)用的淀粉酶產(chǎn)生菌大部分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)[19]、棲熱菌屬(Thermus)[20]和噬纖維菌屬(Cytophaga)[21-22]等.本研究發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)淀粉酶菌株除了常見的芽孢桿菌屬(Bacillus)外，還包括更廣泛的細(xì)菌類群(Streptomyces，Gracilibacillus，Halobacillus，Oceanobacillus，Piscibacillus，Thalassobacillus，Virgibacillus)，說(shuō)明嗜鹽和耐鹽菌中有較多的類群能產(chǎn)生淀粉酶.