檸檬酸稀土對錦江黃牛瘤胃體外發(fā)酵特性的影響

柏 峻， 文露華， 瞿明仁， 李艷嬌， 許蘭嬌

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動物營養(yǎng)重點實驗室/飼料工程研究中心，江西南昌 330045）

我國稀土儲量豐富，位居世界首位，90年代初期，人們開始將稀土應(yīng)用于畜牧業(yè)，目前稀土在豬、雞以及肉牛等動物均有研究和應(yīng)用的報道。在畜牧行業(yè)中的稀土添加劑主要有無機(jī)稀土和有機(jī)稀土。無機(jī)稀土主要是碳酸稀土、氯化稀土和硝酸稀土，適用于養(yǎng)殖業(yè)的有機(jī)酸稀土有抗壞血酸稀土、檸檬酸稀土和氨基酸稀土等。大量研究表明，稀土對動物的飼料轉(zhuǎn)化率、日增重及體內(nèi)消化代謝均有一定的促進(jìn)作用 （Schwabe等，2011；He等，2001）。其中，檸檬酸稀土作為一種極具開發(fā)潛力的添加劑（Ellis 等，2002；桂榮等，1994），在反芻動物上的應(yīng)用仍不夠深入。對我國本地肉牛品種飼養(yǎng)的研究中，在日糧中添加檸檬酸稀土更是鮮有報道。錦江黃牛是江西著名肉牛地方品種之一，飼養(yǎng)量大，是江西主要養(yǎng)殖品種。因此，本試驗旨在通過體外培養(yǎng)技術(shù)，探究檸檬酸稀土對錦江黃牛體外發(fā)酵特性的影響，為檸檬酸稀土在錦江黃牛生產(chǎn)飼養(yǎng)上的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 稀土添加劑 稀土添加劑為檸檬酸稀土，購自江西筐廬科技有限公司，白色或淡黃色流動性粉末，溶于水，粒度＜90目。檸檬酸稀土（≥99%； 其中稀土元素 （以 Re計）≥36%；鎘（Cd）≤0.0001%、鉛（Pb）≤0.002%、砷（As）≤0.0005%。

1.3 瘤胃液供體動物及飼養(yǎng)管理 瘤胃液供體動物為安裝有永久性瘤胃瘺管的健康錦江黃牛3只（體重約為370 kg），采用單欄飼養(yǎng)。粗料為稻草，精料主要為豆柏和玉米，每日兩次等量飼喂（8：00 和 18：00），自由飲水?；A(chǔ)日糧見表 1。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設(shè)計 試驗采用單因素試驗設(shè)計，檸檬酸稀土在基礎(chǔ)日糧中的添加水平見表2。

1.4.2 瘤胃液的采集 于晨飼前，利用長臂手套，通過瘤胃瘺管分別于瘤胃上下前后四個部位采集等量瘤胃液，混合均勻。采集好的瘤胃液迅速灌入經(jīng)預(yù)熱達(dá)39℃的滅菌清潔燒杯中，燒杯置于裝有39℃蒸餾水的保溫瓶中，灌滿后立即蓋好保溫瓶蓋子，迅速返回實驗室，經(jīng)4層紗布過濾后持續(xù)通入氣體5 min，然后迅速分裝至已預(yù)熱好并裝有培養(yǎng)底物（基礎(chǔ)日糧0.5 g）和人工培養(yǎng)液（40 mL）的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶加20 mL瘤胃液。接通培養(yǎng)瓶和注射器，打開振蕩開關(guān)，開始培養(yǎng)。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

表2 試驗分組情況和各組稀土添加量

1.4.3 人工唾液的配置 參照Menke（1988）體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)，0.1 mL微量元素溶液 （A）+208.1 mL緩沖液（B）+205.1 mL 常量元素溶液（C）+1.0 mL刃天青溶液（D）+520.2 mL蒸餾水，通入CO2氣體達(dá)到飽和狀態(tài)，溫度在39℃后維持穩(wěn)定，加62.4 mL還原液（E，該溶液需要現(xiàn)配先用），繼續(xù)通入CO2，直至溶液由淡藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色。

A，B，C，D，E各溶液按如下配方進(jìn)行配制：

A 溶 液 ：1.0 g CoC12·6H2O+10.0 g MnC12·4H2O+13.2 g CaC12·2H2O+8 g FeC13·6H2O， 用蒸餾水溶解并定容至1000 mL；

B 溶液：35 g NaHCO3（分析純）+4.0 g NH4HCO3（分析純），用蒸餾水溶解，并定容至1000 mL；

綜上所述，為確保輸電線路內(nèi)部絕緣子實際運(yùn)行期間不會出現(xiàn)電流泄漏問題，便需電力業(yè)內(nèi)部廣大專業(yè)性地技術(shù)員在實際工作期間愈加關(guān)注該故障問題，通過在線式監(jiān)測系統(tǒng)合理化地應(yīng)用，對輸電線路內(nèi)部絕緣子實際運(yùn)行期間電流泄漏問題，予以實時化地監(jiān)測，切實地避免輸電線路內(nèi)部絕緣子運(yùn)行期間有電流泄漏問題出現(xiàn)，讓輸電線路可一直維持著良好地、安全地運(yùn)行狀態(tài)，保證輸電線路實際運(yùn)行效率。

C 溶液：0.6 g MgS04·7H2O+6.2 g KH2P04（無水）+5.7 g Na2HPO4（無水），加蒸餾水溶解，定容至1000 mL；

D溶液：取100 mg刃天青，用蒸餾水溶解并定容至100 mL；

E 溶液：4.0 mL NaOH （1N）+625 mg Na2S·9H2O+625 mg半胱氨酸鹽酸鹽+95 mL蒸餾水。

1.4.4 樣品的預(yù)處理 培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液立即用pH計測定pH，然后將培養(yǎng)物用紗布過濾，濾液-20℃冷凍保存，用于瘤胃發(fā)酵參數(shù)氨態(tài)氮及菌體蛋白的測定。濾渣無損地轉(zhuǎn)移入尼龍袋中，置于65℃烘箱中烘干至恒重，以測定干物質(zhì)含量。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 產(chǎn)氣量 根據(jù)體外產(chǎn)氣注射器上產(chǎn)氣前后的刻度差直接讀取。

1.5.2 發(fā)酵pH的測定 瘤胃液中pH采用上海雷磁PHS-3C型pH計進(jìn)行測定，測定前使用pH=4.01和pH=6.8的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液對pH計進(jìn)行校正。

1.5.3 氨態(tài)氮 （NH3-N） NH3-N含量按馮宗慈（1993）改進(jìn)方法，采用752紫外可見分光光度計進(jìn)行測定。

1.5.4 微生物蛋白 （MCP） MCP采用考馬斯亮藍(lán)法（Zinn，1986），應(yīng)用752 紫外可見分光光度計來測定培養(yǎng)液中的微生物蛋白含量。

1.5.5 干物質(zhì)消化率（IVDMD）

式中：樣品重量為M1，體外消化后殘渣重量為M2。1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)先用Excel 2003軟件進(jìn)行初步處理，統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0中的 one-way ANOVA程序進(jìn)行方差、線性和二次型分析，多重比較采用 Ducan’s法。

2 結(jié)果分析

2.1 不同添加水平的檸檬酸稀土對錦江黃牛體外發(fā)酵相關(guān)參數(shù)的影響 由表3可知，體外發(fā)酵24 h后，檸檬酸稀土添加組與對照組產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05），添加組產(chǎn)氣量與對照組相比均出現(xiàn)一定程度的下降，隨著檸檬酸稀土添加水平的增加，產(chǎn)氣量出現(xiàn)先降低后增加隨后又降低的現(xiàn)象。其中600 mg/kg組產(chǎn)氣量在添加組中最高，400 mg/kg和1200 mg/kg組產(chǎn)氣量偏低。就pH而言，檸檬酸稀土添加組中600 mg/kg和800 mg/kg兩組均顯著高于對照組，均顯著提高了1.19%（P＜0.05），其余添加組與對照組相比差異均不顯著（P＞0.05），除 1200 mg/kg低于對照組外，其余各組pH均有小幅度增加。另外，檸檬酸稀土添加組與對照組之間錦江黃牛IVDMD的差異不顯著（P＞0.05），其中200 mg/kg組錦江黃牛IVDMD最低，600 mg/kg組錦江黃牛IVDMD最佳，并且在添加組600 mg/kg后，其IVDMD隨著添加濃度的增加會有下降的趨勢，在1200 mg/kg時，降至最低。此外，400 mg/kg組的NH3-N含量較對照組顯著提高了 15.17%（P ＜ 0.05），600、800、1000 mg/kg和1200 mg/kg組的NH3-N產(chǎn)量較對照組分別有所降低，但差異均不顯著（P＞0.05）。通過趨勢性分析，可以反映出檸檬酸稀土添加組的NH3-N產(chǎn)量有先升高后下降的趨勢。而檸檬酸稀土添加組的MCP濃度除1200 mg/kg外，均較對照組有所提高，其中800、1000 mg/kg組的MCP濃度較對照組分別顯著提高21.05%、21.9%（P＜0.05），而1200 mg/kg MCP的濃度最低，比對照組MCP濃度降低了5.55%（P＞0.05）。

表3 不同添加水平的檸檬酸稀土對錦江黃牛體外發(fā)酵的影響

3 討論

3.1 不同添加水平的檸檬酸稀土對錦江黃牛產(chǎn)氣量與干物質(zhì)消化率的影響 Menke和Steingass（1988）通過試驗證實飼料樣品在體外發(fā)酵24 h后的產(chǎn)氣量與瘤胃內(nèi)有機(jī)物的消化率呈顯著的正相關(guān)。試驗中添加檸檬酸稀土組產(chǎn)氣量與對照組相比均出現(xiàn)一定程度的下降，其IVDMD也出現(xiàn)與之相關(guān)的趨勢，其中添加600 mg/kg檸檬酸稀土組產(chǎn)氣量最高，與之對應(yīng)的干物質(zhì)消化率也是最高。說明了適當(dāng)添加檸檬酸稀土在一定程度上能夠促進(jìn)有機(jī)物的降解。鄭茜（2007）研究報道，稀土元素濃度的大小直接影響了其對酶的作用，即當(dāng)稀土元素濃度較低時會激活酶的活性，而當(dāng)稀土元素濃度過高時，會抑制酶的活性。本研究結(jié)果顯示添加1200 mg/kg檸檬酸稀土組產(chǎn)氣量為添加組中最低，這意味著高水平的檸檬酸稀土抑制了有機(jī)物的降解，這與稀土元素濃度過高抑制了酶的活性有關(guān)。曹永范等（2010）研究也表明低濃度的稀土離子能夠激活纖維素酶的活性，而高濃度的稀土元素則會抑制酶的活性，與本次試驗結(jié)果一致。

3.2 不同添加水平的檸檬酸稀土對錦江黃牛體外發(fā)酵pH的影響 瘤胃液pH可綜合反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的變化，pH過高或過低都會影響瘤胃微生物的發(fā)酵。望丕縣等（1991）報道瘤纖維分解菌分解纖維素的最適pH為6.2～7.0。當(dāng)瘤胃pH低于6.2時，纖維分解菌的生長會受到抑制 （趙廣永等，1997），微生物蛋白合成效率下降。本研究發(fā)現(xiàn)，各組pH均保持在6.67～6.76，適合纖維降解菌的生長，沒有對瘤胃內(nèi)環(huán)境造成不良影響。

3.3 不同添加水平的檸檬酸稀土對錦江黃牛體外發(fā)酵NH3-N和MCP濃度的影響 氨氮是瘤胃內(nèi)含氮物質(zhì)分解的終產(chǎn)物，瘤胃內(nèi)的微生物對氨氮的需求需要一個適宜濃度，氨氮濃度過高或過低均不利于瘤胃微生物的生長。Preston（1984）提出微生物對NH3-N濃度的耐受范圍為6 ～ 30 mg/100 mL，Ortega 等（1979）認(rèn)為，NH3-N作為瘤胃微生物的氮源，其濃度的大小對微生物的生長有明顯的影響，且瘤胃微生物生長的最佳NH3-N濃度為6.3～27.5 mg/100 mL。由此可知，本研究中的NH3-N均處于最佳范圍內(nèi)。而在體外發(fā)酵24 h后，其中400 mg/kg組的NH3-N顯著高于對照組（P ＜ 0.05），而 600、800、1000 mg/kg 和1200 mg/kg組的NH3-N濃度較對照組均有降低；檸檬酸稀土的添加組的MCP產(chǎn)量除了1200 mg/kg組外，均較對照組有所提高，其中800、1000 mg/kg組的MCP濃度較對照組分別顯著提高21.05%、21.9%（P＜0.05），說明添加適量的檸檬酸稀土能夠促進(jìn)微生物對NH3-N的利用，合成更多的MCP。于靜等（2010）報道，添加硝酸稀土混合物后微生物蛋白極顯著的增加了34.3%，進(jìn)一步證實瘤胃中添加檸檬酸稀土能促進(jìn)瘤胃微生物蛋白的合成。

4 小結(jié)

添加適當(dāng)水平的檸檬酸稀土能夠有效改善錦江黃牛瘤胃的內(nèi)環(huán)境，提高瘤胃微生物利用NH3-N生成MCP的能力。過高的稀土添加水平會抑制MCP合成及對錦江黃牛瘤胃干物質(zhì)消化率有一定抑制作用。在本試驗條件下，添加檸檬酸稀土的最適范圍為800～1000 mg/kg。