鹽漬對鴨蛋的白蛋白影響

伍佰鑫 ，鄧 平 ，劉成國 （編譯）

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128）

鹽鴨蛋又稱腌蛋或咸蛋，用食鹽腌制，成熟期短，費(fèi)用低廉；其蛋白軟嫩潔白，蛋黃松沙可口，中心油分積聚，外圍油分四溢，色澤桔紅或橙黃；是人們喜愛的傳統(tǒng)食品[1]。鹽鴨蛋中的蛋白含有4%～7%的氯化鈉（味道感覺太咸），可采用脫鹽工藝和電滲析法去除蛋白中的鹽[2]。也可預(yù)先分離新鮮鴨蛋中的白蛋白（用作其它食糜原材料），直接腌制蛋黃[3]。一般情況下，鴨蛋在鹽漬過程中，白蛋白的理化性質(zhì)會(huì)發(fā)生改變，水分含量逐漸下降，而鹽、灰分、蛋白質(zhì)和脂類含量增加；隨著腌制時(shí)間的延長，蒸煮全鴨蛋中的白蛋白硬度變得更低[4]。為了探索鴨蛋腌制期間（30d）白蛋白化學(xué)成分、胰蛋白酶抑制活性與凝膠特性的變化，泰國學(xué)者做了如下研究[5]，可為國內(nèi)蛋品加工行業(yè)創(chuàng)新提供“藥引子”。

1 研究方法

按 1個(gè)蛋/100ml的比例，室溫（28～30℃）配制鹵水或濃鹽水（25%，w/v）備用。從鴨場采集新鮮鴨蛋（產(chǎn)出后24h內(nèi)），用自來水洗干凈，浸入鹵水或濃鹽水。每隔5d隨機(jī)取出一些鹽鴨蛋，手工敲碎、將白蛋白與蛋黃分離，對白蛋白進(jìn)行分析。白蛋白中的水分、蛋白質(zhì)和鹽分含量的測定，分別采用AOAC2000、雙縮尿（反應(yīng)）法和 AOAC2011。運(yùn)用8-苯胺-1-萘磺酸（德國）為探針，根據(jù)熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度（線性回歸分析）的初始斜率，計(jì)算白蛋白的表面疏水性。

胰蛋白酶抑制活性的測定：取200μl白蛋白和 200μl豬胰蛋白酶（0.05mg/ml）37℃培養(yǎng) 15min；添加1000μl反應(yīng)緩沖液 （50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽,其中含有 20mM CaCl2，pH8.2）； 添加200μl苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝基苯胺（2mg/ml，美國）；混合物 37℃培養(yǎng) 15min；添加 200μl的30%乙酸（v/v）；用分光光度計(jì)（日本）測量410nm處的吸光度，對ρ-硝基苯胺的釋放進(jìn)行監(jiān)測；當(dāng)酶引起吸光度增加0.01個(gè)單位/min，就定義為1個(gè)單位的胰蛋白酶活性；使胰蛋白酶活性降低1個(gè)單位，就定義為1個(gè)單位的胰蛋白酶抑制活性。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：取2ml白蛋白與12ml 5%十二烷基硫酸鈉（德國）混合（制備蛋白質(zhì)樣品）；取15μg蛋白質(zhì)樣品置于凝膠（12%電泳膠和4%積層凝膠）之上進(jìn)行電泳（恒流 15mA/凝膠，美國）；用染色液（德國，0.125%考馬斯藍(lán)Coomassie blue R-125滴入25%甲醇和10%乙酸之中）對凝膠進(jìn)行染色；脫色采用40%甲醇和10%乙酸；最后估算蛋白條帶的分子量。

抑制活性染色：取白蛋白樣品與緩沖液（不含β-巰基乙醇）混合；混合樣不做熱處理，分別取15μg置于2個(gè)相同的凝膠之上，通過電泳將蛋白質(zhì)分離，電泳裝置嵌在碎冰中以便減少產(chǎn)生的熱量；其中1個(gè)凝膠固定，用考馬斯藍(lán)R-250染色，作為對照組凝膠；另外1個(gè)凝膠用2.5%聚乙二醇辛基苯基醚沖洗15min，去除十二烷基硫酸鈉，再用蒸餾水沖洗，浸入50ml胰蛋白酶（0.2mg/ml）50mM三羥甲基氨基甲烷的緩沖液中 （其中含有20mM CaCl2，pH8.2）；該凝膠 0～4℃培養(yǎng) 30min、置于室溫60min，讓胰蛋白酶擴(kuò)散到凝膠中；用蒸餾水沖洗后浸入酪蛋白溶液（酪蛋白10mg/ml、50mM三羥甲基氨基甲烷的緩沖液，pH8.2），37℃培養(yǎng)90min；凝膠用蒸餾水漂洗、固定、用考馬斯藍(lán)R-250染色，形成抑制條帶，在清晰的背景上檢測暗帶；通過對照組比較標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)遷移率，估算胰蛋白酶抑制劑的表觀分子量。

白蛋白凝膠制備與分析：先用蒸餾水作溶劑，制備白蛋白溶液（10%固形物），輕輕攪拌均勻；倒入套管 （直徑25mm），兩端都緊緊密封，加熱至90℃保持30min；立即冷卻至4℃并過一夜；分析之前將白蛋白凝膠切割成圓筒狀（直徑25mm、高度30mm）。 采用質(zhì)構(gòu)儀（Model TA-XT2i，英國）分析紋理輪廓：用壓縮圓柱形鋁探頭（直徑50mm）將凝膠壓縮至原始高度的40%；在3mm/s的十字頭速度下，記錄力距變形曲線，記錄速度也是3mm/s；用分析軟件（MicroStable，版本6，英國）評價(jià)硬度、膠粘性、彈性、粘聚性、彈力、咀嚼性和膠質(zhì)。采用色度計(jì)（ColorFlex，美國）分析凝膠的亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）；通過公式 100－[(100－L*)2+a*2+b*2]1/2計(jì)算出白色度。用掃描電子顯微鏡檢測腌制0、15d和30d的鹽鴨蛋蛋白凝膠的顯微結(jié)構(gòu)：將白蛋白凝膠切成小塊（1×1×1mm3），用含有 2.5%戊二醛的0.2M磷酸鹽緩沖液（pH7.2，德國）固定12h；用蒸餾水漂洗1h；用6種濃度 （25%、50%、70%、80%、90%和100%）的乙醇脫水，每個(gè)濃度的脫水15min；對脫水樣品進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥；涂上一層100%金子（濺射噴涂機(jī)SPI-Module，美國）；用掃描電鏡（JEOL JSM-5800LV，日本）觀察凝膠微觀結(jié)構(gòu)。

所有試驗(yàn)一式三份，一共三批樣品；數(shù)據(jù)采用單向方差分析（ANOVA），結(jié)果用平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用多重比較分析樣本之間的差異，統(tǒng)計(jì)分析軟件是SPSS11.0（美國）。

2 研究結(jié)果

2.1 鹽漬時(shí)間對鴨蛋蛋白化學(xué)成分的影響 鹽漬期間，鴨蛋蛋白中的水分持續(xù)減少，從初期的87.93%減少到鹽漬30d的81.20%；同時(shí)，鹽分隨鹽漬時(shí)間延長而增加，從初期的0.31%增加到鹽漬 30d 的 6.19%。 蛋白的亮度（L*）減少、紅度（a*）、黃度（b*）和白色度增加，見表 1。

蛋白質(zhì)表面疏水位點(diǎn)的數(shù)量和相對大小，通常決定蛋白質(zhì)的溶解度，在pH、溫度和離子強(qiáng)度等生理?xiàng)l件下的聚集傾向。鴨蛋蛋白的表面疏水性隨鹽漬時(shí)間延長而逐漸增加，從初期的735.04增加到鹽漬20d的821.45，表明鹽漬誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。在鹽漬的前15d期間，鴨蛋的胰蛋白酶抑制活性持續(xù)下降，只保持63%的活性；鹽漬30d的抑制活性最低 （5.68千單位/mg固體），因此，胰蛋白酶抑制劑的變性可能與其生物活性的喪失有關(guān)，從而推斷抗蛋白酶活性的降低與一些關(guān)鍵蛋白（如類卵母細(xì)胞和卵黃抑制劑）的退化有關(guān)。

表1 鹽漬期間鴨蛋蛋白的水分/鹽分/色澤變化

電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴨蛋蛋白最主要的蛋白質(zhì)是卵清蛋白，分子量為44kda。在非還原條件下，發(fā)現(xiàn)有分子量分別為81、70和16kda的蛋白質(zhì)，分子量為81kda的蛋白質(zhì)更可能是卵傳鐵蛋白，分子量為16kda的蛋白質(zhì)更可能是溶菌酶。對于抑制活性染色，只保留了分子量為44kda的蛋白帶，這種蛋白 （分子量類似）貌似卵清蛋白或其他蛋白質(zhì)，對胰蛋白酶有抑制作用。抑制活性染色未檢出類卵母細(xì)胞和卵黃抑制劑，當(dāng)十二烷基硫酸鈉用于電泳時(shí)，那些抑制劑可能失去了抑制活性，經(jīng)胰蛋白酶消化后，那些蛋白條帶未被保留。鹽漬20d后，分子量為44kda的蛋白帶淡于新鮮鴨蛋和鹽漬10d鴨蛋的蛋白帶，這表明鹽漬期間，有抑制活性的蛋白質(zhì)失去了一些活性，可能歸因于抑制蛋白的構(gòu)象發(fā)生了改變，這一結(jié)果與鴨蛋白在鹽漬過程中降低了胰蛋白酶抑制活性是吻合的，也就是說，鹽漬時(shí)間對降低胰蛋白酶抑制活性有顯著影響。

2.2 鹽漬時(shí)間對白蛋白凝膠特性的影響 隨著鹽漬時(shí)間的增加，白蛋白凝膠的硬度降低 （P＜0.05）；新鮮鴨蛋的白蛋白凝膠硬度值（19.08N）最高，鹽漬30d鴨蛋的白蛋白凝膠硬度值（3.77N）最低，差異顯著（P＜0.05）；鹽漬5d鴨蛋的白蛋白凝膠硬度值（9.26N）就降低了50%，見表2。

表2 鹽漬期間鴨蛋的白蛋白凝膠質(zhì)地變化

與鹽漬鴨蛋的白蛋白凝膠相比，新鮮鴨蛋的網(wǎng)絡(luò)更加密集、空隙更小；鹽漬鴨蛋的白蛋白凝膠有較大的空隙，鹽漬15d的白蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)變得較粗糙，均勻度較低；鹽漬30d與鹽漬15d的白蛋白凝膠質(zhì)地沒有明顯差異，但由于鹽漬 （特別是30d）白蛋白中的蛋白質(zhì)濃度更低、鹽分含量更高，蛋白質(zhì)之間的相互聯(lián)系變得越來越少 （圖1），這與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)強(qiáng)度降低（表2）是吻合的。

圖1 鴨蛋的白蛋白凝膠掃描電鏡照片（放大 1萬倍/比例尺 5μm）

總而言之，鹽漬影響鴨蛋的白蛋白化學(xué)組成和凝膠特性，特別是蛋白酶抑制劑受鹽漬時(shí)間影響，鹽漬可將胰蛋白酶抑制活性減少到一定的程度。分子量為44kda的蛋白質(zhì)在鴨蛋的白蛋白中充當(dāng)胰蛋白酶抑制劑的角色。隨著鹽漬時(shí)間的延長，白蛋白的膠性變得更弱（吃起來感覺無韌性）、白色度增加。鹽漬白蛋白可應(yīng)用于魚糜或其他肉制品，通過強(qiáng)化膠粘性、抑制蛋白質(zhì)水解，改善其適口性等特性。