谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白SLC1A5在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

房信博 馮茜 張旭光 王琳娜

神經(jīng)膠質(zhì)瘤又稱為膠質(zhì)瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%，具有生長迅速，侵襲能力強(qiáng)及易復(fù)發(fā)等特點，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。盡管目前膠質(zhì)瘤的臨床治療已有很大提高，但是其預(yù)后依然很差。膠質(zhì)瘤的發(fā)病原因尚不清楚。但快速增生，發(fā)展迅速是膠質(zhì)瘤細(xì)胞最突出特征。快速增生的膠質(zhì)瘤細(xì)胞必須調(diào)整自身代謝，進(jìn)行代謝重編程[1]，從而盡可能的獲得養(yǎng)分來滿足其快速增生所需。葡萄糖無氧糖酵解被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞的重要能量代謝功能方式之一，但近來研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺也是腫瘤細(xì)胞賴以生存的重要營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。腫瘤細(xì)胞在內(nèi)外因素驅(qū)動下發(fā)生谷氨酰胺代謝重編程，可從細(xì)胞外攝取谷氨酰胺，為生物大分子合成提供碳源，維持氧化還原平衡，調(diào)控增生等相關(guān)活動，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。由此可見葡萄糖和谷氨酰胺均可作為腫瘤細(xì)胞賴以生存的主要原料，阻斷任何一個代謝途徑都有助于腫瘤的治療[5]。SLC1A5是腫瘤細(xì)胞攝取細(xì)胞外谷氨酰胺重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白[6]，在腫瘤細(xì)胞谷氨酰胺代謝中起著重要的作用[7]；但SLC1A5在膠質(zhì)瘤中鮮有研究報道[8]。在本研究中，為明確SLC1A5在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義及體外細(xì)胞系所介導(dǎo)的生物學(xué)作用，我們分別運用免疫組化和RNA干擾技術(shù)分析SLC1A5的表達(dá)及在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生、浸潤中的作用，以期為靶向干預(yù)SLC1A5治療膠質(zhì)瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標(biāo)本 本研究通過了淄博市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會的批準(zhǔn)，手術(shù)樣本獲得均具有患者的知情同意書。收集了2014-01-01—2018-01-01在淄博市中心醫(yī)院神經(jīng)外科進(jìn)行手術(shù)治療的70例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的臨床組織標(biāo)本置于液氮中凍存待用。70例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中，星形膠質(zhì)瘤24例，少突星形膠質(zhì)瘤23例，少突膠質(zhì)瘤23例；發(fā)生轉(zhuǎn)移的22例，未轉(zhuǎn)移48例；女34例，男36例；Ⅰ級8例，Ⅱ級22例，Ⅲ級28例，Ⅳ級12例；直徑小于3 cm的52例，大于3 cm的18例。所有70例患者均有預(yù)后隨訪信息，并且所有膠質(zhì)瘤標(biāo)本HE切片均經(jīng)過臨床病理醫(yī)師核片且確認(rèn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87細(xì)胞購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，在含有青霉素(100 IU/mL)和鏈霉素雙抗(100 IU/mL)，10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)置于5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 主要抗體和試劑 兔抗人SLC1A5單克隆抗體購自武漢華美公司 (貨號：CSB-PA620892DSR1HU，按1∶5 000稀釋)、PV-9000試劑盒和DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。SLC1A5慢病毒載體構(gòu)建包裝等均有上海吉凱公司外包完成。

1.4 免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)Envision二步法操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。膠質(zhì)瘤組織切片經(jīng)過常規(guī)脫蠟，抗原采用0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液微波加熱修復(fù)。以正常兔的IgG取代一抗作為空白對照，用已知的乳腺癌組織作為陽性對照組織。SLC1A5陽性主要定位細(xì)胞膜，少部分細(xì)胞膜細(xì)胞質(zhì)兼呈現(xiàn)黃褐色或棕褐色顆粒。在低倍鏡(×100)下觀察整張切片，隨機(jī)選擇4個高倍視野(×400)計數(shù)陽性細(xì)胞，將膠質(zhì)瘤患者按SLC1A5表達(dá)強(qiáng)度分為高表達(dá)組(陽性著色強(qiáng)度＋＋和＋＋＋)和低表達(dá)組(－和＋)。

1.5 Western blot 收集U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，加入RIPA裂解液置冰上裂解30 min，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白上樣量為30 μg/孔，電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(SLC1A5)4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜，熒光二抗孵育2 h，LI-COR系統(tǒng)(LI-COR，Odyssey)掃膜并定量分析條帶灰度值。

1.6 細(xì)胞增生實驗(MTT) U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)4個復(fù)孔，分別于接種后0、24、48、72和96 h，加入5 mg/mL的MTT溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清，加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，充分震蕩混勻后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.7 細(xì)胞侵襲實驗(Transwell) 配制基質(zhì)膠，將配好的基質(zhì)膠加入到Transwell小室上室，細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置過夜使其充分干燥。Transwell小室下室加入500 μL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基混勻后加入上室，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕擦去上室內(nèi)未遷移的細(xì)胞和基質(zhì)膠，4%多聚甲醛固定，PBS清洗，結(jié)晶紫染色30 min后再用磷酸鹽緩沖液清洗。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取4個視野，計數(shù)每個視野下染色細(xì)胞數(shù)量，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件分析，計量資料采用(±s)表示，符合正態(tài)分布的，采用獨立樣本t檢驗；SLC1A5表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析采用卡方檢驗；單因素生存率分析用Kaplan-Meier檢驗；以檢驗水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

相比較正常腦組織，SLC1A5在膠質(zhì)瘤中顯著性上調(diào)表達(dá)。為明確SLC1A5在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平，我們運用免疫組化檢測了SLC1A5的表達(dá)。SLC1A5主要定位于細(xì)胞膜，部分病例組織細(xì)胞膜和細(xì)胞漿兼而有之。SLC1A5在膠質(zhì)瘤中呈異質(zhì)性表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度從陰性表達(dá)，弱陽性，中陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)均有。但在正常腦組織中，絕大部分正常組織中檢測不到SLC1A5的表達(dá)，只有少部分呈弱陽性表達(dá)。正常腦組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞等均為SLC1A5陰性表達(dá)；相比之下，SLC1A5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中顯著性上調(diào)表達(dá)(圖1)。

圖1 免疫組化檢測SLC1A5在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平

SLC1A5上調(diào)表達(dá)與患者不良預(yù)后及腫瘤大小具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。為明確SLC1A5表達(dá)的臨床病理學(xué)意義，我們運用卡方檢驗及Fisher精確檢驗法分析了SLC1A5表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理學(xué)參數(shù)，包括膠質(zhì)瘤大小(cm)，WHO分級，性別，腫瘤轉(zhuǎn)移，病理亞型(星形膠質(zhì)瘤，少突星形膠質(zhì)瘤及少突膠質(zhì)瘤)和總預(yù)后的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn)SLC1A5高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(圖2)，提示SLC1A5的表達(dá)水平或可作為膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的一個潛在預(yù)測標(biāo)志物。

圖2 Kaplan-Meier預(yù)后生存曲線分析SLC1A5的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的總預(yù)后之間的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。n表示例數(shù)，運用Log-rank統(tǒng)計分析。

此外，SLC1A5上調(diào)表達(dá)還與膠質(zhì)瘤大小，病理分級及腫瘤轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，與其他臨床病理學(xué)參數(shù)不相關(guān)(表1)。

表1 SLC1A5在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義分析(n)

沉默SLC1A5能夠顯著性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的增生和浸潤。為進(jìn)一步探討SLC1A5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生和浸潤中所介導(dǎo)的生物學(xué)作用，我們構(gòu)建了SLC1A5特異性短發(fā)夾RNA干擾(shRNA)慢病毒載體。體外轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞系后，運用western-blot技術(shù)檢測沉默效果，發(fā)現(xiàn)我們構(gòu)建的慢病毒載體能夠有效地沉默SLC1A5蛋白的表達(dá)(圖3A)。之后，我們運用MTT實驗檢測了沉默SLC1A5相比對照組的細(xì)胞增生變化情況(圖3B)，發(fā)現(xiàn)沉默SLC1A5能夠顯著性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增生。進(jìn)一步我們運用Transwell實驗評價了沉默SLC1A5后細(xì)胞浸潤能力的變化(圖3C)，發(fā)現(xiàn)沉默SLC1A5能夠顯著性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的浸潤能力，提示SLC1A5在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增生和浸潤中起著重要作用。

圖3 沉默U87細(xì)胞的SLC1A5能夠顯著性抑制其增生和浸潤

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)除了葡萄糖以外，谷氨酰胺是膠質(zhì)瘤細(xì)胞為適應(yīng)自身快速生長進(jìn)行能量重編程[1，9]所需要的一種重要能源物質(zhì)[3，10]。因此，靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的能量代謝，通過阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞代謝途徑，通過“餓死”膠質(zhì)瘤細(xì)胞可能是一種潛在的新的臨床治療策略[11]。而SLC1A5是定位于細(xì)胞膜上的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白，在腫瘤細(xì)胞攝取細(xì)胞外源性谷氨酰胺中起著重要作用。鑒于此，我們選擇谷氨酰胺轉(zhuǎn)運蛋白SLC1A5作為本研究對象。我們?yōu)榘邢騍LC1A5阻斷膠質(zhì)瘤細(xì)胞以谷氨酰胺為能量替代物質(zhì)作為能量代謝提供重要的理論依據(jù)，因而具有重要的意義。

鑒于SLC1A5在腫瘤谷氨酰胺代謝中的重要性，SLC1A5在惡性腫瘤中已有較多研究報道。但在膠質(zhì)瘤中研究不多見[8，12-13]。目前有關(guān)SLC1A5在膠質(zhì)瘤中的研究多為體外細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)制研究，在體內(nèi)臨床組織水平目前尚未見研究報道。因此，為探討SLC1A5在膠質(zhì)瘤中表達(dá)的臨床病理學(xué)意義及在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞增生浸潤中所介導(dǎo)的生物學(xué)作用，我們運用免疫組化技術(shù)在70例臨床膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中檢測了SLC1A5的表達(dá)水平并分析了其表達(dá)的臨床病理學(xué)意義。我們發(fā)現(xiàn)相比正常腦組織，SLC1A5在膠質(zhì)瘤組織中呈顯著性上調(diào)表達(dá)。其上調(diào)的SLC1A5與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤大小、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后均有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。我們的研究結(jié)果與Bjersand K等在卵巢癌[14]、Toyoda M等在舌癌[15]中的研究報道相一致，提示SLC1A5可能是惡性腫瘤患者不良預(yù)后的一個潛在預(yù)測標(biāo)志物。在本研究中，我們只運用了單因素Kaplan-Meier生存分析，并未探討SLC1A5的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中能否作為一個獨立的預(yù)后相關(guān)因素。因此我們的研究與Liu Y等在腎透明細(xì)胞癌[16]中的研究結(jié)論不一致。Liu Y等發(fā)現(xiàn)SLC1A5的高表達(dá)是腎透明細(xì)胞癌患者的一個獨立預(yù)后因素。在體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，我們發(fā)現(xiàn)沉默SLC1A5能夠顯著性抑制U87細(xì)胞的增生和浸潤，這與國內(nèi)學(xué)者Cai C等[17]在結(jié)直腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)是一致的，即干擾SLC1A5能夠顯著性抑制結(jié)直腸癌的增生和浸潤。盡管如此，SLC1A5的作用機(jī)制依然未知[18]仍待于進(jìn)一步探討。本研究有以下幾點局限性值得注意：首先，本研究所納入的樣本例數(shù)有限，因此有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行多中心驗證；其次，本研究只運用了一種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，因此在體外細(xì)胞系水平仍有待于進(jìn)一步驗證。