一種新型高選擇性次氯酸熒光探針的研制及其應(yīng)用

韓志湘, 蔡春祥, 張功博， 姜夢(mèng)云, 李 輝

(江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

次氯酸(HOCl)是生物體內(nèi)一種重要的活性氧(ROS),可以與DNA、RNA、脂肪酸、膽固醇和蛋白等多種生物分子發(fā)生反應(yīng),具有很強(qiáng)的抗菌功能.然而,HOCl濃度的異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元變性、心血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎等疾病.與傳統(tǒng)的檢測(cè)HOCl方法相比,熒光探針?lè)ň哂羞x擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),尤其是該方法可以與顯微鏡技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中HOCl的可視化成像檢測(cè)[1].近年來(lái),科研人員利用HOCl具有強(qiáng)氧化性的特點(diǎn),將對(duì)甲氧基苯酚[2-3]、硫[4-10]、腙[11]、肟[12-13]、硒[14]等基團(tuán)作為HOCl反應(yīng)位點(diǎn),發(fā)展了許多HOCl熒光探針.但目前報(bào)道的HOCl熒光探針或存在響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),或探針本身熒光背景值較高,或需在堿性條件下檢測(cè)等諸多不足,影響了它的推廣應(yīng)用[15-16].研制高性能HOCl熒光探針仍然是業(yè)界的研究熱點(diǎn).

筆者以具有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的7-二乙胺基香豆素-3-羧酸為熒光團(tuán),將其與2,4-二硝基苯肼通過(guò)酰胺化反應(yīng)鍵聯(lián),利用二硝基苯肼和酰肼中N—N單鍵自由旋轉(zhuǎn)的共同淬滅熒光團(tuán)作用[17-18]獲得一種低熒光背景的熒光探針?lè)肿?(化合物1).同時(shí),HOCl可高效切斷酰肼鍵[15-16],釋放出具有強(qiáng)熒光性能的 7-二乙胺基香豆素-3-羧酸.根據(jù)HOCl加入前后溶液熒光性質(zhì)的顯著不同,構(gòu)建一種具有高信噪比、高選擇性和高靈敏度的HOCl熒光探針,并將其應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)HOCl熒光成像檢測(cè).

1 試驗(yàn)方案

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

熒光測(cè)定使用Thermo Scientific Lumina 熒光分光光度計(jì);紫外吸收光譜的試驗(yàn)使用Shimadzu UV-2400紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);核磁共振氫譜(1H NMR)在Varian INOVA-400核磁共振儀上獲得;溶液pH值使用瑞士Mettler Toledo FiveEasy Plus FE28型 pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定;細(xì)胞成像在Olympus公司的FV1000-MPE多光子激光共聚焦顯微鏡完成.

無(wú)水二氯甲烷、二氯亞砜和乙醚均按照標(biāo)準(zhǔn)方法干燥處理得到.TLC所用硅膠板和柱層析所用硅膠(100～200目)購(gòu)自青島海洋化工廠.其余試劑均為分析純?cè)噭?不需純化直接使用.試驗(yàn)中均使用二次蒸餾水,由優(yōu)普超純水機(jī) UPC-1-5制得.

1.2 探針?lè)肿?的合成

將7-二乙胺基香豆素-3-羧酸(化合物2,0.58 g, 2.2 mmol)加入100.00 mL圓底燒瓶中,逐滴滴加4.5 mL無(wú)水二氯亞砜.氮?dú)庀?室溫?cái)嚢? h.反應(yīng)結(jié)束后,抽濾,所得固體用無(wú)水乙醚洗滌,得黃色固體(0.5 g,產(chǎn)率81.4 %).未經(jīng)純化直接投入下一步反應(yīng).探針?lè)肿?合成路線如圖1所示.

圖1 探針?lè)肿?的合成路線

在100 mL的圓底燒瓶中,將得到的7-二乙胺基香豆素-3-酰氯(0.36 g,1.3 mmol)和2,4-二硝基苯肼(0.16 g,0.8 mmol)溶解于50.00 mL無(wú)水二氯甲烷中,逐滴加入0.25 mL三乙胺.氮?dú)獗Ｗo(hù)下,室溫?cái)嚢?8 h.反應(yīng)結(jié)束后,抽濾,濾餅用二氯甲烷洗滌.真空干燥后,用V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=2 ∶ 1的石油醚-乙酸乙酯為淋洗液柱層析,旋除溶劑,得黃色固體0.25 g,產(chǎn)率為71.7%.

1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ(10-6)：10.56 (s, 1H), 10.26 (s, 1H), 8.89 (d,J=2.8 Hz, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.32 (dd,J=2.8 Hz, 9.6 Hz, 1H), 7.75 (d,J=9.2 Hz, 1H), 7.28 (d,J=9.6 Hz, 1H), 6.88-6.84 (m, 9.2 Hz, 1H), 6.68(d,J=2.0 Hz, 1H), 3.52 (q,J=7.0 Hz, 4H), 1.16 (t,J=7.2 Hz, 6H). ESI-MS(C20H19-N5O7): 測(cè)試值[M+H]+=442.08，[M+Na]+=464.16； 計(jì)算值[M+H]+=442.13，[M+Na]+=464.12.

1.3 測(cè)量過(guò)程

將適量的探針?lè)肿?(化合物1)溶于四氫呋喃中,得到0.001 mol·L-1探針儲(chǔ)備液,-20 ℃貯藏.將適量NaOCl溶液用二次蒸餾水稀釋至0.010 mol·L-1,得到NaOCl標(biāo)準(zhǔn)液.所有光譜檢測(cè)均在體積比為1 ∶ 1的四氫呋喃/PBS緩沖溶液(pH=7.40)混合體系中進(jìn)行的.用移液槍分別移取20 μL探針1儲(chǔ)備液和一定體積NaOCl標(biāo)準(zhǔn)液,加入到2 mL測(cè)試體系中,然后對(duì)其進(jìn)行光譜測(cè)定.熒光激發(fā)波長(zhǎng)為398 nm,激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm,記錄420～600 nm光譜的熒光強(qiáng)度變化.紫外-分光光度計(jì)記錄吸收光譜350～500 nm范圍內(nèi)吸光度變化.

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜性質(zhì)

圖2為探針1(10 μmol·L-1)與不同濃度次氯酸(HOCl)結(jié)合后的熒光光譜圖.由圖2可知:由于雙淬滅基團(tuán)的存在,探針?lè)肿颖旧頍晒夂苋?加入HOCl溶液之后,體系在463 nm處的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),并且隨著HOCl濃度的逐漸增加,體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).

這表明HOCl作用下,酰肼鍵已經(jīng)斷裂,淬滅因素消除,7-二乙胺基-3-羧酸熒光恢復(fù).當(dāng)加入100 μmol·L-1的HOCl時(shí),體系熒光強(qiáng)度相比于探針本身增強(qiáng)了134倍,這表明探針1是一個(gè)具有高信噪比的HOCl熒光探針.

圖2 探針1與不同濃度HOCl反應(yīng)后的熒光光譜

圖3為探針?lè)肿尤芤簾晒鈴?qiáng)度比F/F0與HOCl濃度之間的關(guān)系圖,其中F0和F分別表示濃度為10.0 μmol·L-1探針?lè)肿?中加入不同濃度HOCl前后的熒光強(qiáng)度.由圖3的結(jié)果表明:在0.1～40.0 μmol·L-1的HOCl濃度范圍內(nèi)溶液的熒光強(qiáng)度與HOCl濃度c(HOCl)呈現(xiàn)出很好的線性相關(guān)性(R2=0.997 7),經(jīng)計(jì)算得到其濃度檢測(cè)下限為0.052 μmol·L-1.

圖3 探針?lè)肿尤芤簾晒鈴?qiáng)度與HOCl濃度的線性關(guān)系

圖4為探針?lè)肿?(c(探針1)=10 μmol·L-1)與不同濃度HOCl作用下的紫外-可見(jiàn)吸收光譜.探針?lè)肿?的最大吸收波長(zhǎng)在434 nm;加入HOCl后吸收光譜改變顯著,434 nm處吸光度降低,而407 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰,并不斷增強(qiáng)(藍(lán)移27 nm),等吸光點(diǎn)在403 nm,表明探針1與HOCl反應(yīng)生成了新物質(zhì).

圖4 探針?lè)肿?與HOCl反應(yīng)后溶液的紫外吸收光譜

2.2 反應(yīng)機(jī)理

為揭示探針?lè)肿?對(duì)HOCl的識(shí)別機(jī)理,將探針?lè)肿?與HOCl反應(yīng)的產(chǎn)物進(jìn)行了TLC驗(yàn)證.結(jié)果顯示產(chǎn)物的Rf值與直接合成的7-二乙胺基香豆素-3-羧基一致,表明次氯酸的加入導(dǎo)致探針?lè)肿又絮ｋ骆I的斷裂,釋放了7-二乙胺基香豆素-3-羧基,使溶液的熒光強(qiáng)度增強(qiáng),同時(shí),溶液從無(wú)熒光變?yōu)樗{(lán)色強(qiáng)熒光.探針?lè)肿?識(shí)別HOCl的可能方式見(jiàn)圖5.

圖5 探針?lè)肿?與HOCl的反應(yīng)機(jī)理

為了進(jìn)一步理解探針自身熒光淬滅機(jī)理,通過(guò)高斯09軟件,利用密度泛函理論(DFT),在B3LYP/6-31G* *水平上進(jìn)行優(yōu)化,得到了探針?lè)肿?的HOMO和LUMO軌道圖,如圖6所示.由圖6可知:2,4-二硝基苯肼(供體)軌道能級(jí)在7-二乙胺基香豆素(受體)之間,表明探針?lè)肿?中熒光淬滅是由于香豆素和2, 4-二硝基苯肼之間發(fā)生了光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過(guò)程造成的.

圖6 探針1的HOMO 和LUMO軌道圖

2.3 pH影響

考察了在不同pH的溶液體系下探針?lè)肿优cHOCl反應(yīng)前后的熒光光譜情況,如圖7所示.由圖7可知:未加入HOCl,pH=2.0～10.0時(shí),探針?lè)肿?的熒光強(qiáng)度變化不明顯,表明探針本身對(duì)酸堿度的適應(yīng)性較好,探針的結(jié)構(gòu)不會(huì)隨pH變化而被破壞;加入100 μmol·L-1的HOCl后,pH=2.0～5.0時(shí),溶液體系的熒光強(qiáng)度稍有增強(qiáng);當(dāng)pH=5.0～7.4時(shí),體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng).考慮到在活細(xì)胞中熒光成像的應(yīng)用,試驗(yàn)均在pH=7.4的生理?xiàng)l件下進(jìn)行.

圖7 加入100 μmol·L-1 HOCl前后的熒光強(qiáng)度變化

圖8是探針?lè)肿?對(duì)HOCl的時(shí)間響應(yīng)曲線.由圖8可知:探針?lè)肿?對(duì)HOCl的響應(yīng)較快(約為25 min),表明探針?lè)肿?對(duì)HOCl具有較高的靈敏度.

圖8 探針1與HOCl反應(yīng)后463 nm處熒光強(qiáng)度的變化

2.4 選擇性

圖9為濃度皆為100 μmol·L-1的各種陰離子、HOCl和H2O2溶液等干擾物分別加入10 μmol·L-1

探針?lè)肿?溶液后的熒光強(qiáng)度變化情況.由圖9可知:各種陰離子及H2O2均未引起探針?lè)肿?溶液熒光強(qiáng)度的明顯變化;而HOCl的加入使得探針?lè)肿?溶液的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了134倍,表明探針?lè)肿?對(duì)HOCl表現(xiàn)出了很高的選擇性,為應(yīng)用于實(shí)際樣品中HOCl的檢測(cè)提供了可能.

圖9 探針?lè)肿?對(duì)不同干擾物的選擇性試驗(yàn)

2.5 細(xì)胞試驗(yàn)

鑒于探針?lè)肿?對(duì)HOCl具有信噪比高、檢測(cè)下限低、響應(yīng)速度快、選擇性高和可在生理?xiàng)l件下工作等優(yōu)點(diǎn),試驗(yàn)中將其用于活細(xì)胞中HOCl熒光成像，如圖10所示.HeLa細(xì)胞先用濃度10 μmol·L-1的探針?lè)肿?培養(yǎng)30 min,顯微鏡下幾乎觀察不到熒光(見(jiàn)圖10b);在此基礎(chǔ)上再與濃度10 μmol·L-1HOCl在37 ℃下孵化30 min,可觀測(cè)到非常強(qiáng)的綠色熒光(見(jiàn)圖10d).圖10a,c分別為上述兩種情況中細(xì)胞在明場(chǎng)下觀察到的形態(tài)圖,可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)完好,表明探針?lè)肿?對(duì)細(xì)胞具有低毒性、損傷小等優(yōu)點(diǎn),且探針?lè)肿?能夠用于活細(xì)胞內(nèi)HOCl的可視化識(shí)別.

圖10 明場(chǎng)圖及熒光成像

3 結(jié) 論

1) 設(shè)計(jì)合成了一種具有步驟簡(jiǎn)單、選擇性高、靈敏度好和響應(yīng)能力快速等優(yōu)點(diǎn)的HOCl熒光探針?lè)肿?

2) 由于強(qiáng)淬滅基團(tuán)二硝基苯肼和N—N自由旋轉(zhuǎn)的共同淬滅作用,導(dǎo)致探針?lè)肿幼陨頍晒鈽O弱;探針?lè)肿訉?duì)HOCl識(shí)別具有特異性和高選擇性,增強(qiáng)倍數(shù)較高(134倍),有利于提高探針的靈敏度.

3) 生理?xiàng)l件下,實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中HOCl的可視化識(shí)別.