中華鱉(Pelodiscus sinensis)遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)的分離鑒定與藥物敏感性分析

朱凝瑜，曹飛飛，鄭曉葉，鄭天倫

(浙江省水產技術推廣總站，浙江省水生動物防疫檢疫中心，杭州 310023)

中華鱉(Pelodiscussinensis)是中國水產養(yǎng)殖名優(yōu)產品中的主要品種之一，在浙江、安徽、江蘇、湖北、湖南、江西、廣東等地區(qū)廣泛養(yǎng)殖，營養(yǎng)價值與經濟價值高，深受廣大養(yǎng)殖者與消費者青睞。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴大和集約化程度的提高，中華鱉病害的發(fā)生日趨嚴重，造成嚴重的經濟損失，阻礙了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。總體來說，細菌性疾病在中華鱉中最為常發(fā)[1-2]，如穿孔病、潰爛病、白點病、白底板病、紅底板病和紅脖子病等。引起細菌性疾病的病原種類繁多，目前報道較多的有嗜水氣單胞菌[3-4]、溫和氣單胞菌[1-5]、遲緩愛德華氏菌[6-7]、弗氏檸檬酸桿菌[8-9]等。其中，白底板病具有發(fā)病面廣、發(fā)病率和死亡率高等特點，已成為嚴重危害中華鱉產業(yè)發(fā)展的細菌病之一。該病在5～8月份流行，發(fā)病高峰期水溫22～32 ℃，將鱉由溫窒移往外塘時易患此病，氣溫突變(如寒潮、連續(xù)陰雨天等)也容易誘發(fā)該病[10]。

2017年，本實驗室從蕭山某中華鱉規(guī)?；B(yǎng)殖場暴發(fā)白底板病的病鱉中分離到1種優(yōu)勢菌，稚鱉回歸感染實驗證實其具有致病力，進一步對該菌株的主要生物學性狀、16S rRNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育、藥敏試驗等進行了研究，旨在為該病的診斷及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與耗材

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)、瓊脂粉購于北京陸橋技術有限責任公司；DNA提取試劑盒、PCR試劑、引物購于上海生工生物技術有限公司；藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.2 實驗動物

患白底板癥狀的病鱉(約400 g)于7月底采自杭州蕭山某規(guī)模化養(yǎng)殖場。用于回歸感染試驗的健康稚鱉購于天福養(yǎng)殖場，4～6 g/只。暫養(yǎng)一周，養(yǎng)殖用水為曝氣2 d的自來水，pH 7.2，水溫(25±2) ℃。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)

75%酒精棉球擦拭體表消毒后，無菌手術刀剪開病鱉腹部，采集病鱉的肝臟、脾臟、腎臟等，用接種環(huán)蘸取后劃線接種于BHI瓊脂平板上。30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢單菌落純化后擴大培養(yǎng)于BHI液體培養(yǎng)基中，加甘油(直至25%，V/V) 于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 生化鑒定

革蘭氏染色，根據結果選擇相應鑒定卡，于全自動微生物鑒定儀(VITEK 2，法國梅里埃)中進行菌種鑒定。

1.2.3 分子鑒定

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取純化菌株的基因組模板，采用細菌16S rRNA通用引物：F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，進行PCR擴增。擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳后，送上海生工生物技術有限公司測序。

1.2.4 16S rRNA 基因序列系統(tǒng)進化樹構建

將測序所得的菌株16SrRNA序列在GenBank數據庫中經Blast比對，選取相似性較高的序列，采用Clustal X(1.83)進行多序列同源性比對(Multiple alignments)，按鄰接法(Neighbor-joining method)用MEGA 4.0軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 回歸感染實驗

取分離株接種于BHI液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)

24 h后，離心后用無菌生理鹽水將細菌沉淀調成4.5×105、4.5×106、4.5×107及4.5×108CFU/mL。將50只稚鱉平均分為5組，每組10只。試驗組4組，分別經腹腔向每只稚鱉注射4.5×105～4.5×108CFU/mL不同濃度的菌液0.1 mL；對照組注射等量無菌生理鹽水。連續(xù)觀察7 d，記錄其發(fā)病及死亡情況。

1.2.6 藥敏試驗

按常規(guī)紙片擴散法進行[11]。通過比濁法調整細菌濃度至108CFU/mL，吸取200 μL純培養(yǎng)物均勻涂布于BHI瓊脂平板，用無菌鑷貼上各種藥敏紙片，30 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。每個藥物均設3個平行，取平均值后參照NCCLS的判斷標準進行判定。

2 結果

2.1 病鱉癥狀及剖檢變化

病鱉行動遲緩，浮于水面，攝食減少，體表完好無損，底板蒼白(圖1A)。解剖可見，血液量減少，肝臟腫脹色深，質脆易碎、有花紋(圖1B)，腎腫漲，胃充盈有積液(圖1C)，腸套疊、梗死，出血嚴重，腸道內有出血塊(圖1D)。

圖1 病鱉癥狀及病理變化圖A1：病鱉白色底板，A2 正常鱉底板；B：肝臟腫脹，有花紋(箭頭處)；C：胃充積液(箭頭處)；D：腸內血凝塊。Fig.1 The pathological symptoms of diseased Chinese soft-shelled turtleA: white abdominal shell of diseased turtle (A1) and healthy turtle (A2); B: liver with swollen, brittle and pattern(Showed with arrow);C: swelling stomach with fluid (Showed with arrow); D: infracted intestinal tract with blood clot.

2.2 細菌分離及菌落形態(tài)觀察

從病鱉肝臟、脾臟、腎臟等組織及胃積液分離到一種外觀特征較一致的優(yōu)勢菌落，其表面濕潤光滑、微隆起、半透明，呈灰黃色。菌株革蘭氏染色陰性，鏡檢形態(tài)為短桿狀。

2.3 生化鑒定

基于VITEK 2的64個生化反應的分析提示，分離株t39-w-1呈L-阿拉伯醇、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇陰性，葡萄糖發(fā)酵、H2S、D-麥芽糖、D-葡萄糖、賴氨酸脫羧酶等陽性，鑒定結果為遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)，其具體生理、生化特性見表1。

2.4 分子鑒定

用細菌16S rRNA通用引物對上述菌株的基因組模板進行PCR擴增，獲得長度約1 400 bp的片段。序列經Blast比對分析后，與遲緩愛德華氏菌同源性均在98%以上。從NCBI基因序列數據庫中下載3株遲緩愛德華氏菌，16株其他腸桿菌科的菌株，包括沙門氏菌屬(Salmonella)、耶爾森菌屬(Yersinia)、埃希氏菌屬(Escherichia)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、變形桿菌屬(Proteus)、愛德華氏菌屬(Edwardsiella)等6個菌屬，構建系統(tǒng)進化樹(圖2)。結果顯示，分離株與遲緩愛德華氏菌聚為一支。綜合形態(tài)、生化特征以及16S rRNA序列分析結果，確定分離株t39-w-1為遲緩愛德華氏菌。

表1 分離菌株的生理性狀Tab.1 Physiological and biochemical characterizations of the isolated bacterium

圖2 基于16S rRNA 構建的菌株系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the isolated strain based on 16S rRNA

2.5 回歸感染實驗

分離株t39-w-1 對健康稚鱉的回歸感染實驗結果見表2。結果顯示，高劑量組(4.5×107CFU)的稚鱉攻毒后24 h內死亡7只，48 h內全部死亡；中劑量組(4.5×106CFU)7 d內死亡8只；低劑量(4.5×105和4.5×104CFU)組未見異常，無死亡。對照組稚鱉未見異常。從人工感染稚鱉的肝臟、腎臟中分離到純度較高、與接種菌株形態(tài)相同的菌落，經VITEK 2鑒定同樣為遲緩愛德華氏菌，生化特征與接種菌株一致，提示該菌為引起中華鱉發(fā)病死亡的病原菌。

表2 t39-w-1 菌株對健康稚鱉的感染試驗結果Tab.2 Results of artificial infection of t39-w-1 to healthy juvenile turtles

2.6 藥敏實驗

取分離株t39-w-1開展藥敏實驗，結果顯示，該菌株對慶大霉素、阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南等5種抗生素高度敏感，對恩諾沙星中度敏感，而對青霉素G、氟苯尼考、四環(huán)素、多西環(huán)素、林可霉素、萬古霉素、復方新諾明等7種抗生素耐藥(表3)。

表3 t39-w-1菌株的藥敏試驗結果Tab.3 Results of antimicrobial sensitive test of t39-w-1

3 討論

遲鈍愛德華氏菌屬腸桿菌科愛德華氏菌屬，為革蘭氏陰性條件致病菌，無莢膜，不形成芽胞，周鞭毛，有運動力。該菌在世界范圍內廣泛存在，為人畜魚共患病原菌[12]，一定條件下能引起人的胃腸炎和免疫系統(tǒng)的破壞[13]。由于它的廣鹽性，在水產養(yǎng)殖中危害也很大，能引起多種水生生物的出血性敗血癥、腹水病、潰爛病等，如歐洲鰻鱺、烏鱧、大菱鲆、異育銀鯽等[14-18]。本研究中，病鱉的底板蒼白，肝臟腫脹質脆，胃積水，腸套疊、梗死，從其肝臟、腎、胃積液中分離到一致的唯一優(yōu)勢菌——遲緩愛德華氏菌，通過回歸感染試驗能導致稚鱉死亡，證實其存在致病性。

16S rRNA基因序列測定已被廣泛用于細菌分類和鑒定上，但由于16S rRNA序列的高度保守性，特異性區(qū)域相對較少，因此常難以區(qū)分同一屬內的相近種。另外，愛德華氏菌屬的各種之間差異較小，不時有新種出現[10]，因此很難憑借16S rRNA鑒定到種。在細菌分類鑒定時，將分子鑒定與生化特性相結合，可使鑒定結果更可靠、準確、科學。本研究中的分離株t39-w-1在序列比對時，發(fā)現其與遲緩愛德華氏菌、?？茞鄣氯A氏菌、鲇魚愛德華氏菌的同源性均在98%以上。結合菌落的形態(tài)特征及生化特性，并做系統(tǒng)進化分析，綜合判定分離菌為遲緩愛德華氏菌。

目前，引起白底板病的主要病因尚無定論，許多研究發(fā)現其是由一種或多種病菌共同引起的，如江為民等[19]從病鱉體內僅分離到遲緩愛德華氏菌一種細菌，且能重新復制出該病癥狀；陳曉風等[20]認為中華鱉白底板病的病原為細菌，且為嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌和普通變形桿菌混合感染致??；沈錦玉等[10]認為白底板病由病毒和嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌混合感染引起。另有學者認為，當飼料酸值超過20時，中華鱉易患白底板病[21]；鱉的白底板病與出血性腸道壞死癥有著密切聯系[22]。可見，中華鱉白底板病的成因較為復雜，細菌性病原、病毒性病原、飼料以及環(huán)境因素均能引起該病的發(fā)生。本研究從具有明顯白底板癥狀的患病中華鱉中僅分離到遲緩愛德華氏菌一種優(yōu)勢菌，回歸感染試驗中能使稚鱉出現血液減少，肝臟腫大癥狀，與發(fā)病病鱉癥狀相同，并能引起稚鱉死亡，證實其致病性。后期將繼續(xù)選用幼鱉、成鱉進行實驗，以進一步豐富和驗證白底板病的發(fā)病原因。

中華鱉的細菌性疾病多以癥狀命名，可能存在一癥多病和一病多癥的情況，不同癥狀可能是同一病原在不同階段的不同表現， 而不同病原也有可能引起相同的癥狀[23]。本研究中藥物敏感試驗表明，分離到的遲緩愛德華氏菌對慶大霉素、阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南等5種抗生素高度敏感，為該病的防治提供了一定的科學依據。但與其他分離菌株藥敏結果[8,10,17]有所差異，有的甚至呈現截然不同的結果，說明細菌的藥物敏感性與菌株本身、地域用藥習慣及環(huán)境等有關[8]。因此，在生產過程中，簡單的“對癥下藥”并不完全可行，有必要針對病原進行藥敏試驗，篩選敏感藥物進行疾病防治，在提高治療效果的同時，也可避免因亂用、濫用藥物造成的藥物殘留超標和環(huán)境污染等問題。

4 結論

本研究從患白底板病的病鱉中分離到1種優(yōu)勢菌，經形態(tài)觀察、生理生化鑒定和16S rRNA序列分析確定為遲緩愛德華氏菌。回歸感染實驗表明分離到的遲緩愛德華氏菌具有致病性。藥敏試驗表明該菌對慶大霉素、阿米卡星、新霉素、頭孢哌酮、氨曲南等5種抗生素較為敏感。在實際生產中，建議針對病原進行藥敏試驗，篩選敏感藥物進行疾病防治，科學合理使用藥物。