基于蒙脫石負(fù)載的阿糖胞苷復(fù)合物的制備

謝華松,劉澤朗,劉嘉姚,胡燕蕓,王傳嶺

(嘉應(yīng)學(xué)院,廣東 梅州 514031)

阿糖胞苷(Cytosine arabinoside,Ara-c),為白色或類(lèi)白色細(xì)小針狀結(jié)晶或結(jié)晶性粉末,在水中極易溶解,它屬于嘧啶核苷類(lèi)抗腫瘤藥物,用于治療以急性淋巴細(xì)胞白血病和非霍奇金淋巴瘤為主的各種類(lèi)型的白血病[1]。目前阿糖胞苷在治療過(guò)程中存在嚴(yán)重缺陷:1)在體內(nèi)容易在脫氨酶的作用下發(fā)生脫氨基反應(yīng),轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)活性的阿糖尿苷;2)分子水溶性大,膜透過(guò)性差;3)半衰期短,只有10～20 min;4)用于實(shí)體瘤的治療效果差;5)常出現(xiàn)手足綜合征(HFS)和口腔炎等副作用[2-3]。阿糖胞苷由于以上缺點(diǎn)導(dǎo)致其在臨床上應(yīng)用受到限制,因此,探索開(kāi)發(fā)載藥量高、安全有效的 Ara-C藥物遞送系統(tǒng)成為當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。

天然蒙脫石(MMT)是由兩層硅氧四面體夾一層鋁(鎂)氧八面體構(gòu)成的2∶1型層狀硅酸鹽黏土礦物,是組成膨潤(rùn)土的主要礦物,其晶體結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元層以分子間力結(jié)合,結(jié)構(gòu)比較松散,四面體中的Si4+可以被Al3+置換,八面體中的Si4+、Al3+易被Mg2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+等置換,形成一系列復(fù)雜化學(xué)成分和層間負(fù)電荷,這些特征賦予它遇水膨脹、吸附、帶電和離子交換特性具有非常高的比表面積、較大的陽(yáng)離子交換容量和可膨脹性[4]。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域,蒙脫石可作為生物分子層間吸附劑[5]、藥物載體[6]和電化學(xué)生物傳感器[7]等。

近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外大量學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)蒙脫石是一種性能優(yōu)良的緩控釋制劑載體,并已有多種藥物以蒙脫石作為新型緩控釋載體的研究報(bào)道,如:蒙脫石負(fù)載5 -氟尿嘧啶[8]、鹽酸異丙嗪[9]、紫杉醇[10]、布洛芬[11]等。由于蒙脫石具有良好的生物惰性、吸附性和離子交換容量,作為載體它還具備吸附量大、穩(wěn)定性好、將藥物分子吸附交換至層間,延長(zhǎng)藥物的半衰期,減少用藥劑量,起到“緩釋、控釋”的作用。本文擬設(shè)計(jì)制備阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物,并測(cè)定蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的載藥量,為后期開(kāi)發(fā)具有緩釋作用的新型阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器:電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(101-3型),上海錦屏儀器儀表有限公司;超聲波清洗機(jī)(JP-100S型),深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;集熱式恒溫磁力攪拌器(DF-101S型),常州越新儀器制造有限公司;電子分析天平(AL204型),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;X-射線衍射儀(X’Pert PRO MPD型),荷蘭Panalytical公司;熱重分析儀(Q500型),美國(guó)TA公司;傅里葉紅外光譜儀(IS5/IS10型),美國(guó)Thermo Nicolet公司;高效液相色譜儀(LC-2030 plus型),島津馬來(lái)西亞工廠;離心機(jī)(GL-25M型),上海趙迪生物科技有限公司;超純水機(jī)(MING-CHE 24UV型),法國(guó)Merck Millipore公司;酸度計(jì)(PHSJ-4A型),上海精密科學(xué)儀器有限公司。

試劑:鈉基蒙脫石(上海源葉生物科技有限公司);阿糖胞苷(C9H13N3O5)(上海源葉生物科技有限公司);聚乙二醇(PEG1000)(上海源葉生物科技有限公司);高效色譜純甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司);磷酸二氫鈉,二水(NaH2PO4·2H2O)(阿拉丁);氫氧化鈉(NaOH)(天津市福晨化學(xué)試劑廠);磷酸氫二鈉,十二水(Na2HPO4·12H2O)(阿拉丁);磷酸二氫鉀(KH2PO4)(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鈉基蒙脫石有機(jī)化改性處理[12]

取市售鈉基蒙脫石(MMT) 5.0 g于40 mL蒸餾水中,在60 ℃恒溫超聲分散15 min,在恒溫磁力攪拌器中60 ℃分散2.0 h,隨后加入0.20 g PEG1000,繼續(xù)攪拌1.5 h,反應(yīng)完成后加入乙醇沉淀并離心,烘干研磨即得改性蒙脫石,以下蒙脫石均采用已改性蒙脫石進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物的制備[13]

取阿糖胞苷0.200 0 g,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超聲分散15 min,加入0.500 0 g改性蒙脫石,于45 ℃恒溫反應(yīng)3.0 h,取出,以10 000 r/min離心15 min,倒去上清液,將剩余下層沉淀烘干,待水分完全烘干后研磨成粉末狀,即得。

2.3 阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 X射線衍射(XRD)表征

采用X射線粉末衍射分別對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物測(cè)定,以8 °/min的速度在3°～70°范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

2.3.2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征

采用傅里葉紅外光譜檢測(cè),分別對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物測(cè)定,用粉體常規(guī)壓片,波長(zhǎng)范圍400～4 000 cm-1。

2.3.3 熱重分析(TG-DTG)表征

采用熱重分析分別對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物測(cè)定,測(cè)試溫度范圍為25～799 ℃,測(cè)試氣體氛圍為氮?dú)?升溫速率10 ℃/min。

2.4 蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的吸附實(shí)驗(yàn)

2.4.1 供試品溶液的制備

取0.200 0 g阿糖胞苷,加入pH值=7.6的PBS溶液50 mL,超聲分散15 min,加入0.500 0 g 改性蒙脫石,于45 ℃恒溫反應(yīng)3.0 h,取出,以10 000 r/min離心15 min,吸取上清液,0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液稀釋至適合濃度,即得。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備

取阿糖胞苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,加超純水溶解并定量稀釋制成每l mL中含40 μg阿糖胞苷的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.4.3 色譜條件[1,14]

色譜柱:用十八烷基硅烷鍵合硅膠(4.6 mm×250 mm,4 μm)為填充劑;流動(dòng)相:以磷酸鹽緩沖液[V(取0.010 6 mol/L磷酸二氫鈉溶液與0.010 4 mol/L磷酸氫二鈉溶液等體積混合)∶V(甲醇)=95∶5];柱溫:30 ℃;取適量阿糖胞苷標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm;設(shè)置流速:0.8 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL,洗脫時(shí)間:8 min。

2.4.4 阿糖胞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線[1,14]

精密稱(chēng)取阿糖胞苷約10 mg置于10 mL容量瓶中,分別用pH值7.6 PBS溶液溶解并定容,配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液50,100,200,400,600 μL置于10 mL容量瓶中,用PBS溶液稀釋并定容得質(zhì)量濃度為5,10,20,40,60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,各進(jìn)樣10 μL,按照2.4.3項(xiàng)測(cè)定其峰面積,以峰面積(A)對(duì)濃度(C)作線性回歸,得阿糖胞苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.5 蒙脫石的載藥量[1,2]

按照2.4.1項(xiàng)平行制備三份供試品溶液,精密量取供試品溶液各10 μL ,注入HPLC中,記錄色譜圖,按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算阿糖胞苷游離量,然后以公式(1)計(jì)算蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的載藥量。

載藥量(%)=載藥蒙脫石中阿糖胞苷含量/載藥蒙脫石的總質(zhì)量×100%

(1)

3 結(jié)果與討論

3.1 阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物的結(jié)構(gòu)表征

3.1.1 X射線衍射(XRD)表征分析

按照2.4.1項(xiàng)對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物進(jìn)行XRD表征,見(jiàn)圖1,根據(jù)布拉格方程2dsinθ=nλ(n=1),可以計(jì)算出,其001晶面的層間距分別是1.560和1.718 nm,可見(jiàn)復(fù)合物中d001值比空白改性蒙脫石的大,說(shuō)明可能由于阿糖胞苷的插入會(huì)占據(jù)原來(lái)空白改性蒙脫石晶體結(jié)構(gòu)的一部分空間,使得材料的層間距(d值)增加,所以初步確定阿糖胞苷插入在蒙脫石層間;另一方面,插層后復(fù)合物的衍射峰角度比空白改性蒙脫石的要小,分析其原因可能是阿糖胞苷插入后占據(jù)了原來(lái)材料基本晶格結(jié)構(gòu)中的空隙,引起晶格收縮,從而導(dǎo)致衍射峰角度出現(xiàn)左移變化。由以上兩方面綜合分析可判斷阿糖胞苷成功插入蒙脫石層間,這與郭文姬等人的文獻(xiàn)[15]描述相一致。

圖1 阿糖胞苷-蒙脫石和空白改性蒙脫石的XRD譜

3.1.2 傅里葉紅外光譜(FT-IR)表征分析

按照2.4.1項(xiàng)對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物進(jìn)行FT-IR表征,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物的FT-IR表征,發(fā)現(xiàn)空白改性蒙脫石在3 629和3 468,1 639 cm-1處的波峰分別是由Al-OH和吸附水中的羥基振動(dòng)引起的。1 096和1 036 cm-1處的波帶是由Si-O平面振動(dòng)引起的,大約在915 cm-1處的波數(shù)與Al-Al-OH有關(guān),792 cm-1和大概630 cm-1處的波數(shù)是由Si-O-Si所引起的,而大約520和470 cm-1處的波數(shù)則是由Al-O-Si的振動(dòng)引起。而在3 600 cm-1處的波峰變?nèi)?分析其變?nèi)醯脑蚴前⑻前蘸兔擅撌诜磻?yīng)過(guò)程中,蒙脫石中的游離型-OH基團(tuán)大部分轉(zhuǎn)變成了締合型-OH基團(tuán),游離型-OH基團(tuán)在紅外光譜中常表現(xiàn)為強(qiáng)的吸收峰,而締合型-OH基團(tuán)在紅外光譜中表現(xiàn)為弱的吸收峰,導(dǎo)致締合型的吸收峰弱于游離型,所以-OH振動(dòng)峰變?nèi)?綜合以上結(jié)果表明蒙脫石與阿糖胞苷應(yīng)該形成了復(fù)合物。

圖2 阿糖胞苷-蒙脫石和空白改性蒙脫石的FT-IR譜

3.1.3 熱重分析(TG-DTG)表征分析

按照2.4.1項(xiàng)對(duì)空白改性蒙脫石和阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物進(jìn)行TG-DTG表征,見(jiàn)圖3、圖4。由圖3中可知,空白改性蒙脫石從室溫到200 ℃范圍內(nèi),存在較大的失重?fù)p失,有4%左右,表明吸附水逸出;隨著溫度上升,在300～500 ℃處出現(xiàn)明顯失重,大約4%左右,可能是由于蒙脫石晶格內(nèi)羥基破壞開(kāi)始釋放水;在700 ℃之后出現(xiàn)第三個(gè)明顯失重,可能是蒙脫石結(jié)構(gòu)已造成破壞。由圖4中可知,阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物有兩個(gè)比較明顯的失重臺(tái)階。從室溫到200 ℃的范圍內(nèi)存在6%左右的失重,對(duì)比空白改性蒙脫石,多出了2%左右的失重,表明是部分吸附水揮發(fā)和阿糖胞苷熱分解引起的;隨著溫度的繼續(xù)升高,在300～650 ℃的范圍內(nèi),失重?fù)p失為2%左右,對(duì)比改性蒙脫石,要比蒙脫石少2%左右,說(shuō)明阿糖胞苷與蒙脫石進(jìn)行插層時(shí)失去了蒙脫石層間部分水,導(dǎo)致其失重偏小;當(dāng)溫度達(dá)到700 ℃后,失重曲線回升,可能是阿糖胞苷的分解產(chǎn)物與蒙脫石反應(yīng)引起的,表明阿糖胞苷與蒙脫石形成了復(fù)合物。

圖3 空白改性蒙脫石的TG-DTG譜

圖4 阿糖胞苷-蒙脫石的TG-DTG譜

3.2 蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的吸附實(shí)驗(yàn)

3.2.1 阿糖胞苷的最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定

按照2.4.2項(xiàng)制備對(duì)照品溶液,然后取適量阿糖胞苷對(duì)照品進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知,在271 nm處有最大吸收,由此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為 271 nm。

圖5 阿糖胞苷全波長(zhǎng)掃描圖

3.2.2 阿糖胞苷在3種溶液下的標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照2.4.4項(xiàng)建立阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果見(jiàn)表1;以峰面積(A)對(duì)濃度(C)作線性回歸方程,得阿糖胞苷在相應(yīng)釋放介質(zhì)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線,據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出線性擬合方程(y= 29 292x+ 4 870.9),相關(guān)系數(shù)為0.999 9,結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

表1 阿糖胞苷在pH值7.6 PBS溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

3.2.3 蒙脫石的載藥量

蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,由表2可知,蒙脫石載藥量約為1.42%,結(jié)果表明,蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的載藥量不是很高,后續(xù)可深入探究?jī)?yōu)化阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物的制備工藝條件。

表2 蒙脫石對(duì)阿糖胞苷的吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本文設(shè)計(jì)制備阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物,通過(guò)結(jié)構(gòu)表征分析確定制備得到阿糖胞苷-蒙脫石復(fù)合物,其載藥量約為1.42%,研究結(jié)果為制備新型阿糖胞苷-蒙脫石緩釋制劑提供參考依據(jù),也為其在藥理學(xué)的研究提供理論支撐。