Fmr1基因敲除小鼠的三箱社交新奇偏好行為觀察

陳 錫 陳楚茂 許宏烽 羅朝文 馮嘉欣 李秋霞 柯思楷 陳盛強(qiáng) 鄧小燕

在社會(huì)上,人們通過傳遞信息、交流思想，以達(dá)到某種目的的各種活動(dòng)，就是社會(huì)交往，簡稱社交。人行為的產(chǎn)生是極其復(fù)雜的過程，由于內(nèi)外環(huán)境的變化作用于相應(yīng)的感覺器官，導(dǎo)致個(gè)體對(duì)這種變化產(chǎn)生相應(yīng)的行為[1]，這是社交行為產(chǎn)生的機(jī)制。人們在社會(huì)中通過彼此間的社交，能讓自己融入這個(gè)社會(huì)。對(duì)于許多動(dòng)物來說，社交同樣重要。社交行為障礙是許多精神疾病的重要特征，例如自閉癥、抑郁癥和精神分裂癥等。因此，社交行為的變化就成了判斷許多精神疾病的標(biāo)準(zhǔn)之一。為了在動(dòng)物模型上研究社交行為的變化，人們開發(fā)出了許多行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，其中包括較為成熟的針對(duì)小鼠的“三箱社交行為實(shí)驗(yàn)”。三箱社交行為通過分析主要反映小鼠的社交新奇偏好，其原理是基于小鼠對(duì)新物件具有探索傾向的特性?？赏ㄟ^小鼠在實(shí)驗(yàn)第二階段的三箱各區(qū)域的活動(dòng)水平來反映其社交行為。

脆性 X 綜合征(Fragile X Syndrome, Fra(X)S)屬于 X 連鎖不完全顯性遺傳病, 該病是由 X 染色體上的 FMR1基因改變引起 FMR蛋白表達(dá)異常造成的[2]。臨床表現(xiàn)主要為不同程度的認(rèn)知功能損害，精神行為異常，青春期后出現(xiàn)巨睪丸，部分患者可出現(xiàn)長臉、招風(fēng)耳、高腭弓等面部特點(diǎn)及孤獨(dú)癥樣的行為特征[3]。目前國內(nèi)對(duì)脆性 X 綜合征小鼠的社交新奇偏好的研究較少。本研究對(duì)正常小鼠的FMR1基因進(jìn)行敲除建立脆性X綜合征的小鼠模型，采用三箱的方法對(duì)6 周齡 Fmr1 基因敲除小鼠及野生型小鼠的社交新奇偏好進(jìn)行分析，旨在探討脆性 X 綜合征小鼠是否有社交新奇偏好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)FVB近交系小鼠來自荷蘭伊拉斯塔斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中心 Ostra BA 教授的贈(zèng)送，包括Fmr1 基因野生型( WT) 純合子及其敲除型( KO) 純合子，于廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為6周齡 KO 和 WT 組，每組15 只，共兩組，體質(zhì)量15～17 g；同時(shí)準(zhǔn)備不同籠6周齡KO和WT組，每組兩只，共兩組, 體質(zhì)量15～17 g。三箱實(shí)驗(yàn)于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室操作。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和操作均遵循3R原則。

1.1.2 主要設(shè)備與儀器 該三箱系統(tǒng)主要由三個(gè)矩形艙室、長方體容器、視頻分析系統(tǒng)組成。每個(gè)矩形艙室規(guī)格為20 cm×40 cm×23 cm，中間有通道使三箱相通，通道規(guī)格為6 cm×6 cm; 長方體容器高17 cm，底部邊長為7.2 cm；攝像頭安放于三箱上方2 m高度。 按左中右將三個(gè)矩形艙室平均劃分為3個(gè)象限，在左上和右下各劃分一個(gè)邊長7.2 cm的正方形象限。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因型的鑒定 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基因型的鑒定參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]。

1.2.2 三箱實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置 三箱視頻分析系統(tǒng)參數(shù)選擇為白鼠黑色背景，二值化處理的閾值設(shè)定為20。實(shí)驗(yàn)在安靜的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)時(shí)光源等保持不變。

1.2.3 三箱實(shí)驗(yàn)(Three-chamber Test) 三箱含有三個(gè)艙室，在左右艙室里各放一個(gè)空金屬籠子，將測試小鼠(KO/WT)沿中間艙室側(cè)壁放入三箱內(nèi)，讓其適應(yīng)10 min。實(shí)驗(yàn)第一階段，將測試小鼠(KO/WT)取出，在左側(cè)艙室里的金屬籠子里，放入一個(gè)球狀物，在右側(cè)艙室里的金屬籠子里，放入一只同籠同性別小鼠；將測試小鼠(KO/WT)沿中間艙室側(cè)壁放入三箱內(nèi)，讓測試小鼠(KO/WT)在三個(gè)艙室中自由活動(dòng)10 min。實(shí)驗(yàn)第二階段，將測試小鼠(KO/WT)取出，有球狀物的金屬籠子中，用一只不同籠同性別小鼠取代球狀物，將測試小鼠(KO/WT)沿中間艙室側(cè)壁放入三箱內(nèi)，使測試小鼠(KO/WT)在三個(gè)艙室中自由活動(dòng)，同時(shí)使用攝像頭跟蹤小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡并用SMART軟件記錄下相關(guān)參數(shù)：測試小鼠與金屬籠接觸的次數(shù)和時(shí)間(金屬籠周圍4.0 cm定義為接觸范圍)，記錄10 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠鑒定結(jié)果

KO和WT小鼠基因PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見圖1。

2.2 小鼠第二階段軌跡圖

見圖2、圖3。

2.3 三箱實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)分析了實(shí)驗(yàn)小鼠在第二階段分別與熟悉小鼠、陌生小鼠接觸的次數(shù)和時(shí)間，以了解其在三箱中的社交新奇偏好。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于WT組，在第二階段KO組與陌生小鼠接觸的次數(shù)和時(shí)間顯著減少，P<0.05。見表1、圖4、圖5。

表1 Fmr1基因敲除小鼠三箱的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 (n=15,n)

注：n熟表示第二階段與熟悉小鼠接觸的次數(shù)；t熟表示第二階段與熟悉小鼠接觸的時(shí)間(s)；n陌表示第二階段與陌生小鼠接觸的次數(shù)；t陌表示第二階段與陌生小鼠接觸的時(shí)間(s)

實(shí)驗(yàn)第二階段，WT小鼠和KO小鼠分別跟陌生小鼠與熟悉小鼠接觸時(shí)間比較。與 WT小鼠相比，KO小鼠與陌生小鼠接觸時(shí)間明顯減少，P<0.05。見圖4。

圖4 Fmr1基因敲除小鼠三箱實(shí)驗(yàn)第二階段的接觸時(shí)間分析

實(shí)驗(yàn)第二階段，WT小鼠和KO小鼠分別跟陌生小鼠與熟悉小鼠接觸次數(shù)比較。與 WT小鼠相比，KO小鼠與陌生小鼠接觸次數(shù)明顯減少，P<0.05。見圖5。

圖5 Fmr1基因敲除小鼠三箱實(shí)驗(yàn)第二階段的接觸次數(shù)分析

3 討論

社會(huì)行為包括社會(huì)性決策、社會(huì)性記憶、社會(huì)性信息加工等[5]。社交新奇偏好屬于社會(huì)行為的一種。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)KO和WT小鼠三箱行為進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)KO小鼠在實(shí)驗(yàn)第二階段與陌生小鼠接觸的時(shí)間、次數(shù)比WT小鼠明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明與WT小鼠相比，KO小鼠沒有社交新奇偏好，與Oksana KB等[6]的研究結(jié)果一樣。對(duì)于WT小鼠有社交新奇偏好，而KO小鼠沒有社交新奇偏好的原因，可能是由于野生型小鼠是群居動(dòng)物，它們具有一定的社會(huì)屬性，當(dāng)它們在與同類相互接觸后，能形成一定的社會(huì)記憶，而這一社會(huì)記憶能進(jìn)一步影響它們的社會(huì)決斷。所以當(dāng)面對(duì)新奇陌生個(gè)體時(shí)，正常小鼠會(huì)回憶起之前接觸并熟悉的同類的記憶。對(duì)它們而言，新奇的同類更具有誘惑性，因此，在同時(shí)面對(duì)熟悉和完全陌生的同類時(shí)，正常小鼠總是愿意與陌生個(gè)體接觸更長的時(shí)間，表現(xiàn)出社交新奇偏好；而KO小鼠之所以沒有社交新奇偏好，可能是由于其Fmr1基因被敲除，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，對(duì)新奇事物探索的欲望下降，引起社交新奇偏好散失。

雖然三箱社交測試存在耗時(shí)長(一次實(shí)驗(yàn)需要40 min左右)的缺點(diǎn)，但這幾年隨著三箱社交測試的發(fā)展與運(yùn)用，三箱社交測試已經(jīng)被證明可以提供標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程，而且操作簡單，是比較動(dòng)物社交新奇偏好的較好方法；三箱社交測試正越來越頻繁地被用作社交新奇偏好的指標(biāo)[7-10]。本實(shí)驗(yàn)通過三箱社交測試結(jié)合計(jì)算機(jī)的采集和分析技術(shù)，記錄FMR1基因敲除小鼠及野生型小鼠活動(dòng)的全過程，并分析其運(yùn)動(dòng)軌跡，得到了相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)脆性X綜合征小鼠沒有社交新奇偏好，提示脆性X綜合征患者可能沒有社交新奇偏好。