Reversine對肝星狀細胞凋亡及相關蛋白表達的影響

黃 迪 黃 宇 翁杰鋒 黃子圣 麥振豪 張 強 張漢意 張 帥 古維立

肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一種多途徑、多因素參與的過程，主要病理改變是細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)的過度合成與異常沉積。肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)是參與肝纖維化形成最重要的細胞，HSCs的活化、增殖被認為是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1]，而抑制HSCs增殖、誘導其凋亡成為抗肝纖維化的重要策略。逆轉(zhuǎn)素(Reversine)作為一種人工合成的小分子嘌呤衍生物，已被證實具有誘導成熟細胞去分化的作用，它能夠讓高度分化的細胞回復到祖細胞狀態(tài)，而這些回復到祖細胞的狀態(tài)的細胞具有分化為不同類型細胞的潛力[2-3]。Reversine的這種促使細胞返老還童的特性的發(fā)現(xiàn)為抗肝纖維化藥物的研發(fā)提供了一個新的思路。已證實在大鼠肝纖維化模型中，Reversine可以通過降低肝纖維化中升高的α-SMA的表達而起到抑制肝纖維化程度的效果[4]。明確Reversine對HSCs的具體影響以及相關機制對于防治肝纖維化有重要意義。因此，本實驗通過流式細胞術、細胞免疫熒光相結(jié)合的方法，在體外細胞水平探討Reversine對HSCs細胞增殖、凋亡作用以及與肝纖維化相關蛋白質(zhì)表達的差異，為進一步揭示肝纖維化的發(fā)展機制及Reversine抗肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

肝星狀細胞(中山大學動物實驗中心細胞庫)； Reversine(Sigma公司)；cck-8試劑盒(東仁化學科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基干粉、胎牛血清、DMSO(Sigma公司)；anti-TGF-β1(SAB4502954)、ANTI-SHC1(AB-427)(SAB4300557)、ANTI-RGN(HPA029103)(Sigma公司)；caspase-3 antibody(#9662， Cell Signaling公司)；mAb anti-Aurora B antibody(NB110-55480，Novusbio公司)；ANTI-CDKN2A/p16INK4a[2D9A12](ab54210，Abcam公司)；SMAD2/3 Antibody(BA1395，博士德生物工程有限公司)；FITC標記羊抗鼠IgG(H+L)、FITC標記羊抗兔IgG(H+L)(Abbkine公司)；FACS Calibur流式細胞儀(BD公司)；Annexin-V-FITC/PI 凋亡試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)；生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱CCL-170A8(ESCO藝思高公司)；多功能酶標儀(香港基因有限公司)；IX51倒置相差顯微鏡(Olympus)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HSCs用體積分數(shù)為10%胎牛血清加1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，于二氧化碳培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)中培養(yǎng)，細胞換液時間為1～2 d，傳代時間為3～5 d，傳代前用2.5 g/L的胰酶消化。

1.2.2 實驗分組 以加入DMSO的HSCs作為正常對照組；加藥組：加Reversine干預，終濃度分別為5、10、20、40 μg/mL，每組藥物干預時間為24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測HSCs增殖情況 取對數(shù)期生長的細胞，胰酶消化后，調(diào)整細胞密度為1×105個/毫升，接種于96孔板中，每孔100 μL，棄周圍一圈改加1×PBS 100 μL保持濕度，不做測量，每組做5個復孔。待細胞長至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，按照分組情況加入藥物干預，同時設立空白對照組(加培養(yǎng)基100 μL)作為調(diào)零用途，24 h后加入CCK-8試劑，與培養(yǎng)基按1 ∶10的比例加入，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，多功能酶標儀檢測波長為450 nm處的吸光度OD值。實驗重復7次。細胞抑制率計算方法：R抑制=1-(A加藥-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

1.2.4 FACS Calibur流式細胞儀檢測HSC的凋亡 取對數(shù)期生長的細胞，胰酶消化后制成細胞懸液，接種于3.5 cm培養(yǎng)板中，待細胞長至80%滿后，棄掉原培養(yǎng)基，以1×PBS輕輕沖洗一遍，按照分組情況加入藥物干預，24 h后胰酶消化收集細胞，1×PBS洗滌細胞兩次，制成細胞懸液，用300目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，計數(shù)取1×105個細胞，離心后用500 μL的 Binding Buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC以及5 μL PI，混勻，室溫避光反應15 min， 1 h內(nèi)完成檢測。每組實驗重復7次。

1.2.5 細胞免疫熒光法檢測TGF-β1、caspase-3、Aurora B、collagen-I、SMAD2/3、Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白的表達情況 按分組情況制成細胞爬片后，新鮮配制的4%多聚甲醛固定20 min， 0.5%Triton X-100對細胞透化處理10 min，5%BSA封閉1 h后加入一抗(用1%BSA 1∶100稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日加入熒光標記的二抗(用1%BSA 1∶100稀釋)，室溫避光孵育1 h，加入0.5 μg/mL DAPI染核10 min，每做一項處理后都用1×PBS洗滌3次，封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 13.0軟件，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)、LSD-t檢驗，數(shù)據(jù)均以mean±SD 表示，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Reversine對HSCs增殖的影響

在未加入藥物處理的情況下，HSCs增殖明顯，當分別加入不同濃度(5、10、20、40 μg/mL)Reversine后，HSCs增殖受到抑制，其抑制率分別為38.03±9.05、44.97±5.85、55.33±2.40、64.19±3.66，F(xiàn)=27.356，P=0.000，兩兩比較p<0.05，可見Reversine對HSC增殖抑制呈現(xiàn)劑量對應關系，見圖1。利用SPSS 13.0軟件測得Reversine在24 h對HSC的IC50值為13.45 μg/mL。

注：*表示P<0.05，***表示P=0.000圖1 不同濃度Reversine處理24 h對HSC增殖的影響

2.2 不同濃度Reversine引起HSCs凋亡

經(jīng)Calibur流式細胞儀檢測顯示，對照組僅有少量細胞發(fā)生凋亡，總凋亡率為(2.36±0.61)%；而不同濃度Reversine干預HSCs 24 h后存在不同程度的凋亡(見圖2)。其中，Reversine濃度為5 μg/mL的總凋亡率(13.14±1.87)%與對照組比有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；當濃度上升到40 μg/mL時，總凋亡率為(21.24±1.07)%，凋亡效果更佳明顯，說明Reversine可以誘導HSC凋亡，且呈現(xiàn)劑量效應關系，見表1。同時我們將早晚期凋亡情況分開分析發(fā)現(xiàn)，同一濃度Reversine作用HSCs，晚期凋亡細胞要多于早期凋亡細胞。但無論是早期還是晚期凋亡，隨著Reversine濃度的增加，HSCs凋亡也隨之增加(見圖3)。值得注意的是，Reversine的劑量從20 μg/mL增加到40 μg/mL時，其凋亡率并沒有隨之顯著增加，兩組相比P=0.295，沒有統(tǒng)計學差異，其原因可能為在達到一定濃度后，Reversine使得HSCs的周期停滯在某個時期，而并不是直接引起HSCs的凋亡。

圖2 不同濃度Reversine處理24 h對HSCs凋亡的影響

組別早期凋亡率(%)晚期凋亡率(%)總凋亡率(%)對照組0.50±0.441.86±0.722.36±0.615 μg/mL組5.36±1.231)7.79±1.041)13.14±1.871)10 μg/mL組7.63±0.921)2)8.22±0.921)15.85±1.001)2)20 μg/mL組8.99±1.251)2)3)11.58±0.591)2)3)20.57±0.901)2)3)40 μg/mL組9.60±1.381)2)3)11.64±0.591)2)3)21.24±1.071)2)3)

注：1)表示與對照組比較，P<0.01，2)表示與5 μg/mL組比較，P<0.01，3)表示與10 μg/mL組比較，P<0.01，n=7

注：*表示與對照組比較P<0.01，#表示與5 μg/mL組比較，P<0.01，Δ表示與10 μg/mL組比較，P<0.01，n=7

圖3不同濃度Reversine處理24 h對HSCs凋亡的影響

2.3 Reversine干預HSCs后相關蛋白的表達

在熒光顯微鏡下可觀察到正常對照組HSCs的細胞核染色及大小較均一；當用Reversine處理HSCs后，HSCs凋亡細胞逐漸增多，表現(xiàn)為細胞核大小不均、核濃縮、裂解、凋亡小體及多倍體的形成。于是，我們利用細胞免疫熒光法定性檢測了在20 μg/mL的Reversine干預HSCs后對TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3、Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白的表達的影響，見圖4，發(fā)現(xiàn)Reversine干預HSCs后，可以檢測到caspase-3、TGF-β1、SMAD2/3、Aurora B蛋白的熒光表達，而Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白未見相關熒光表達。

3 討論

肝星狀細胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。正常情況下肝星狀細胞處于靜止狀態(tài)，當致肝病因子造成肝細胞損傷時，激活的Kupffer細胞、竇內(nèi)皮細胞及損傷的肝細胞等分泌多種細胞因子和化學介質(zhì)共同作用于HSCs，使HSCs激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，激活的HSCs通過自分泌和旁分泌，促進HSCs增殖，合成大量ECM并在肝內(nèi)沉積，導致肝纖維化[5]。因此，HSCs的活化是肝纖維化形成的關鍵，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，那么阻斷HSCs活化并促進活化HSCs的凋亡對逆轉(zhuǎn)肝纖維化具有實用價值。

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠肝纖維化模型中，Reversine可以通過降低肝纖維化中升高的α-SMA的表達而起到抑制肝纖維化程度的效果[4]。但是，我們?nèi)圆磺宄eversine抑制肝纖維化的具體機制。鑒于HSCs對于肝纖維化的重要性，我們通過不同濃度的Reversine處理體外培養(yǎng)的HSCs，探究Reversine對HSC細胞的影響。通過CCK-8法增殖試驗發(fā)現(xiàn)，在體外5 μg/mL的Reversine即可明顯抑制HSC細胞的活性，其24 h抑制率達(38.03±9.05)%，當劑量增至40 μg/mL時，抑制率增加至(64.19±3.66)%，呈現(xiàn)一種劑量效應關系。通過計算，我們得出Reversine在24 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為13.45 μg/mL。流式細胞術作為檢測細胞早期凋亡的首選方法，是目前最為理想的凋亡定量檢測方法[6]。我們通過流式細胞術檢測了Reversine對HSCs早期凋亡和晚期凋亡情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一定濃度下Reversine作用HSCs后，晚期凋亡細胞要多于早期凋亡細胞，但無論是早期還是晚期凋亡，隨著Reverssine濃度的增加，HSCs凋亡也隨之增加，且呈現(xiàn)劑量對應關系。但是值得注意的是，本實驗Reveersine的劑量從20 μg/mL增加到40 μg/mL時，其凋亡率并沒有隨之顯著增加，而是達到相對穩(wěn)定的狀態(tài)，究其原因可能是在達到一定濃度后，Reversine使得HSCs的細胞周期停滯在某個時期，而并不是直接引起HSCs的凋亡。

注：A表示Caspase-3；B表示TGF-β1；C表示SMAD2/3；D表示Aurora B

引起HSCs激活和凋亡的分子機制十分復雜，包括TGF-β1/Smad 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑、MAPK介導的信號轉(zhuǎn)導途徑、PDGF 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑、PPAR信號途徑、NF-κB 信號通路、Wnt 信號轉(zhuǎn)導通路等。本實驗利用細胞免疫熒光法定性檢測了在5 μg/mL的Reversine干預HSCs后對相關蛋白影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Reversine干預HSCs后，可以檢測到TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3蛋白的熒光表達，而Desmin、p16INK4a、SMP-30、p66SHC等蛋白未見相關熒光表達。肝纖維化反應的是細胞外基質(zhì)的合成與降解的失衡，表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)合成大于降解。在肝纖維化的過程中，細胞外基質(zhì)的主要成分包含各種膠原蛋白，其降解過程受到金屬蛋白酶及其抑制劑(MMPs/TIMPs)的調(diào)控相關。TGF-β1既是HSC啟動階段分子調(diào)控最強的促進因子，同時也是持續(xù)激活階段的細胞因子。TGF-β1是肝臟中呈高表達的亞型，通過與Smads結(jié)合而發(fā)揮生物學活性，能直接和間接刺激HSC的活化和增殖。TGF-β1的表達水平與肝纖維化的嚴重程度呈顯著正相關。由此我們推測Reversine引起HSCs凋亡可能和TGF-β1/Smad介導的信號轉(zhuǎn)導途徑、caspase-3蛋白途徑有關，其中具體相關蛋白的定量表達情況，本研究組將在下一步實驗中進一步研究。

綜上所述，本實驗通過Reversine體外干預HSCs細胞，證實了Reversine能抑制肝星狀細胞的增殖，誘導其凋亡，并且影響肝星狀細胞TGF-β1、caspase-3、Aurora B、SMAD2/3等蛋白質(zhì)的表達，其相關機制可能與TGF-β1/Smad 介導的信號轉(zhuǎn)導途徑、caspase-3蛋白途徑有關。