葡萄葉片表皮氣孔與霜霉病的抗性研究

杜蕙 蔣晶晶 王春明 郭建國(guó) 漆永紅

摘要：采用室內(nèi)離體接種結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查，研究了8個(gè)葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性，結(jié)果表明，不同品種對(duì)葡萄霜霉病的抗性差異較大，高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對(duì)霜霉病表現(xiàn)抗?。≧），奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對(duì)霜霉病表現(xiàn)感病（S），瑞比爾表現(xiàn)高感（HS）。對(duì)8個(gè)葡萄品種的葉片表皮氣孔觀察表明，不同品種葉片氣孔大小、密度不同。氣孔密度由大到小依次為奧古斯特、矢富羅莎、夏黑、貴妃玫瑰、高妻、醉人香、紅地球、瑞必爾。氣孔的開(kāi)張面積從大到小依次為醉人香、高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾、矢富羅莎。各品種葉片氣孔的密度及大小與霜霉病的抗性未表現(xiàn)出一定規(guī)律。

關(guān)鍵詞：葡萄;葉片表皮氣孔;霜霉病;抗性

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.631.1? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ?文章編號(hào)：1001-1463（2018）12-0058-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.12.017

葡萄霜霉病是由葡萄生單軸霉菌[Plasmopara.viticola]引起的葡萄生產(chǎn)上最重要的病害之一，世界各地葡萄產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是一種世界性病害[1 - 2 ]。我國(guó)1899 年發(fā)現(xiàn)該病危害[3 ]，目前幾乎所有葡萄產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，潮濕多雨地區(qū)危害更為嚴(yán)重，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)嚴(yán)重影響樹(shù)勢(shì)和果實(shí)品質(zhì)[4 ]。目前關(guān)于葡萄霜霉病的抗性研究主要集中在品種抗病性鑒定、病菌致病性分化及抗藥性等方面 [5 - 9 ]，有學(xué)者對(duì)與抗性有關(guān)的葡萄葉片組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研? ? 究[10 - 13 ]，但不同學(xué)者的研究結(jié)果不同。我們以生產(chǎn)中主栽的鮮食葡萄品種為材料，觀察了不同葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性及葉片表皮的氣孔，以期豐富葡萄霜霉病抗性機(jī)理研究。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

植物材料為葡萄室內(nèi)盆栽苗，品種有：紅地球、夏黑、高妻、瑞必爾、醉人香、貴妃玫瑰、奧古斯特、矢富羅莎。普通型塑料透明膠帶，寬度為 18 mm，厚度為0.05 mm。

供試葡萄品種于2013年秋季扦插于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所溫室中。2014年8月從田間采集新鮮的葡萄霜霉病的葉片，用自來(lái)水反復(fù)沖洗掉老孢子囊后，在20 ℃條件下黑暗保濕培養(yǎng)24～48 h。待新孢子囊長(zhǎng)出后用毛筆刷下，用無(wú)菌水配制成濃度為1×105～1×106個(gè)/mL孢子囊懸浮液備用。

1.2? ?試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 供試品種對(duì)霜霉病的抗性評(píng)價(jià)? ? 采用室內(nèi)離體葉片法結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查進(jìn)行品種抗性評(píng)價(jià)。室內(nèi)離體葉片測(cè)定時(shí)，分別采集供測(cè)試葡萄品種新梢大小和葉齡基本一致的健康葉片，將事先準(zhǔn)備好的孢子囊懸浮液用喉頭噴霧器在葉片背面均勻噴灑10 mL，然后將葉片正面朝下放在鋪有四層無(wú)菌水浸濕滅菌紗布的瓷盤(pán)中，為避免葉片與濕紗布接觸腐爛，在葉片下放置玻璃棒，葉柄用脫脂棉保濕，磁盤(pán)用保鮮膜覆蓋密封，于20 ℃條件下黑暗保濕培養(yǎng)。以噴等量清水為對(duì)照，每品種接種10片葉，重復(fù)3次。逐日觀察記錄發(fā)病情況，用接種后第7天的調(diào)查數(shù)據(jù)計(jì)算病情指數(shù)。

田間自然發(fā)病調(diào)查參考劉天明等[13 ]的方法。2014年，在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果花卉研究所葡萄園分別在霜霉病初發(fā)期（7月5日）、盛發(fā)期（8月16日）及發(fā)病后期（9月22日）共進(jìn)行3次調(diào)查。每品種選取20個(gè)新發(fā)的枝條，每枝自上而下調(diào)查10個(gè)葉位相同葉片，記錄發(fā)病情況，計(jì)算平均病情指數(shù)。室內(nèi)及田間病害調(diào)查分級(jí)方法按0級(jí)，無(wú)病斑;1級(jí)，病斑面積占葉面積5%以下;3級(jí)，病斑面積占葉面積6%～25%;5級(jí)，病斑面積占葉面積26%～50%;7級(jí)，病斑面積占葉面積? ? ?51%～75%;9級(jí)，病斑面積占葉面積76%以上進(jìn)行。品種抗性評(píng)價(jià)參考劉新秀等[14 ]的5級(jí)分級(jí)法，即免疫（I），病情指數(shù)為0;高抗（HR），病情指數(shù)為0.1～5.0;抗?。≧），病情指數(shù)為5.1～25.0;感?。⊿），病情指數(shù)為25.0～50.0;高感（HS），病情指數(shù)為50.0～100.0。

1.2.2? ? 不同葡萄品種葉片表皮氣孔壓片制作? ? ?采用透明膠帶粘取法[15 ]。塑料透明膠帶拉開(kāi)10～15 cm，膠面朝上，平放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)面上。帶葉柄剪取葡萄葉片（第3～5片新葉），用水輕輕沖洗后用濾紙迅速吸干表面水分。左手捏住葉柄，將葉片正面粘在膠帶上。在粘貼過(guò)程中，先將葉尖粘貼在膠帶上，然后將葉片向葉背面彎曲逐漸向前推移，使葉片正面與膠帶充分接觸。為了防止粘貼過(guò)程中葉片皺縮，應(yīng)右手持解剖針，置于葉片與膠帶之間進(jìn)行調(diào)整，使葉片平整地粘貼在膠帶上。然后剪去葉柄。將膠帶對(duì)折過(guò)來(lái)平整地粘貼在葉片的背面。然后用手指對(duì)捏膠帶，使膠帶與葉片兩面充分粘著。將對(duì)折的膠帶撕開(kāi)，葉片正面仍緊密粘貼在膠帶上，葉片背面與膠帶分離，并將葉片下表皮粘貼在膠帶上。若葉面附著物較多，膠帶不能與表皮緊密粘著時(shí)，可用膠帶連續(xù)重復(fù)粘貼葉片，直到粘去附著物后，粘取下表皮。為了防止粘取的表皮材料相互重疊，在連續(xù)重復(fù)粘貼時(shí)應(yīng)更換膠帶新的部位粘著表皮。

將帶葉片下表皮的膠帶沿表皮輪廓剪成 3～5 mm × 3～5 mm 的矩形片。在載玻片上滴1滴蒸餾水、1滴 1% 的碘-碘化鉀染液，將帶葉片表皮的膠帶膠面向下置載玻片上染色 0.5～1.0 min，蓋上蓋玻片，壓平后即制成氣孔壓片。

1.2.3? ? 不同葡萄品種葉片表皮氣孔測(cè)定? ? 將制好的氣孔壓片在40倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每品種分別觀察5張制片，分別量取50個(gè)氣孔的縱徑、橫徑，求其平均值。

氣孔數(shù)目測(cè)定：在顯微鏡下數(shù)得每1視野中氣孔的數(shù)目，計(jì)算10個(gè)視野的平均值。

氣孔開(kāi)張面積計(jì)算：S=縱徑×橫徑× 3.14 × 0.25（單位μm2）。

氣孔密度計(jì)算：氣孔數(shù)/mm2 =視野氣孔數(shù)/視野面積。

視野面積計(jì)算：S=πr2（r為視野半徑）。

1.3? ?數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性

通過(guò)室內(nèi)離體接種結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查，供試品種對(duì)葡萄霜霉病的抗性評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1，高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對(duì)霜霉病表現(xiàn)抗?。≧），奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對(duì)霜霉病表現(xiàn)感?。⊿），瑞比爾表現(xiàn)高感（HS）。各品種在室內(nèi)接種條件下病情指數(shù)均高于田間自然發(fā)病的病情指數(shù)，可室內(nèi)離體接種所提供的環(huán)境條件更有利于霜霉病的發(fā)生。

2.2? ?不同葡萄品種葉片表皮氣孔觀察

通過(guò)對(duì)不同品種葡萄葉片表皮氣孔壓片的觀察，發(fā)現(xiàn)葡萄葉片表皮有大量氣孔存在。8個(gè)品種氣孔密度在55～99個(gè)/mm2，不同品種葉表皮氣孔數(shù)量差異較大。單位面積氣孔數(shù)量由多到少的順序?yàn)閵W古斯特、矢富羅莎、夏黑、貴妃玫瑰、高妻、醉人香、紅地球、瑞必爾。氣孔的開(kāi)張面積從大到小的順序?yàn)樽砣讼?、高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾、矢富羅莎。

3? ?結(jié)論與討論

通過(guò)室內(nèi)離體接種結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查，8個(gè)葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性不同。高妻、夏黑、醉人香及矢富羅莎對(duì)霜霉病表現(xiàn)抗病，奧古斯特、紅地球及貴妃玫瑰對(duì)霜霉病表現(xiàn)感病，瑞比爾表現(xiàn)高感。對(duì)不同品種葡萄葉片表皮氣孔觀察表明，奧古斯特葉表皮氣孔密度最大，其次為矢富羅莎、夏黑、高妻、貴妃玫瑰、醉人香、紅地球及瑞比爾。從氣孔的大小看，醉人香氣孔最大，其次為高妻、貴妃玫瑰、紅地球、夏黑、奧古斯特、瑞必爾及矢富羅莎。

植物的一些結(jié)構(gòu)特征，如角質(zhì)層、氣孔、葉片茸毛等均對(duì)病原物的侵入表現(xiàn)出一定的抗性。關(guān)于氣孔在抗霜霉病中的作用， 不同學(xué)者有不同看法。王國(guó)英[11 ]的研究認(rèn)為葡萄對(duì)霜霉病的杭性與葉片氣孔的密度有極顯著的關(guān)系。感病類(lèi)型葉片氣孔密而大，抗病類(lèi)型葉片氣孔少，且氣孔周?chē)邪咨逊e物。一旦病菌從氣孔侵入后，很快會(huì)產(chǎn)生孢囊梗和孢子囊，氣孔就不能再關(guān)閉，從而不僅奪取寄主的營(yíng)養(yǎng)，還會(huì)使蒸騰作用明顯增強(qiáng)，這與吉麗麗[10 ]的研究結(jié)果一致。但劉天明[13 ]等認(rèn)為氣孔大小、密度及晝夜開(kāi)閉程度與葡萄抗感病性無(wú)關(guān)，且氣孔密度、氣孔橫徑、氣孔縱徑與病級(jí)間也無(wú)顯著相關(guān)性。Boubals D. [16 ]認(rèn)為，氣孔在抗病性中的作用很小，但氣孔保衛(wèi)細(xì)胞死亡會(huì)導(dǎo)致游動(dòng)孢子萌發(fā)管以及菌絲體的死亡。關(guān)于氣孔大小的劃分界限，不同研究者有不同的標(biāo)準(zhǔn)。 我們將保衛(wèi)細(xì)胞縱徑大于30 μm的定為大氣孔，15～30 μm的定為普通氣孔，小于15 μm者為小氣孔。據(jù)此，8個(gè)品種中只有瑞比爾和矢富羅莎的氣孔屬于小氣孔，其他6個(gè)品種的氣孔均屬于普通氣孔，且透明膠帶粘取法觀察植物氣孔的方法操作簡(jiǎn)單、方便，能較好地反映氣孔的大小。

本試驗(yàn)表明，氣孔的密度及大小與霜霉病的抗性無(wú)直接關(guān)系。如較抗霜霉病的品種高妻，其氣孔大小、氣孔密度均高于高感霜霉病的品種瑞比爾，其他品種對(duì)霜霉病的抗性與其氣孔大小及密度間也無(wú)規(guī)律可循。李華[12 ]認(rèn)為葉片氣孔對(duì)游動(dòng)孢子向性引力大小，也是構(gòu)成葡萄對(duì)霜霉病抗性的主要因素?？共∑贩N葉片上可侵入的孢子數(shù)目顯著低于感病品種， 而感病品種葉片的氣孔比抗病品種對(duì)游動(dòng)孢子有更大的向性引力。葡萄對(duì)霜霉病的組織結(jié)構(gòu)抗性是多種多樣的，氣孔僅為葡萄霜霉病菌進(jìn)入葉片組織的通道。本研究?jī)H對(duì)8個(gè)葡萄品種進(jìn)行了研究，探究氣孔與葡萄對(duì)霜霉病抗性的關(guān)系還需進(jìn)行更多品種、更深入的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙奎華，陶承光，劉長(zhǎng)遠(yuǎn)，等.? 葡萄病蟲(chóng)害原色圖鑒[M].? 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006：6-7.

[2] 杜? ?蕙，王春明，鄭? ?果，等.? 不同來(lái)源葡萄霜霉病菌對(duì)4種殺菌劑的敏感性[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2017（10）：41-44.

[3] 李海強(qiáng).? 石河子地區(qū)葡萄霜霉病的發(fā)生規(guī)律及防治研究[D].? 石河子：石河子大學(xué)，2009：1-2.

[4] 劉? ?旭，楊曉暢，陶? ?怡，等.? 葡萄霜霉病拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].? 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2015，

32（4）：681-688.

[5] 張國(guó)軍，徐海英，閆愛(ài)玲.? 部分葡萄品種葡萄霜霉病田間調(diào)查[J].? 中國(guó)果樹(shù)，2005（4）：49-50.

[6] 畢秋艷，馬志強(qiáng)，韓秀英，等.? 葡萄霜霉病菌對(duì)甲霜靈抗藥性治理及其田間抗藥菌株遺傳穩(wěn)定性分析[J].? 植物病理學(xué)報(bào)，2014，44（3）：302-308.

[7] 張艷艷，張劍俠，王躍進(jìn).? 中國(guó)野生葡萄抗霜霉病基因 RAPD 標(biāo)記的篩選[J].? 果樹(shù)學(xué)報(bào)，2008，25（6）：816-820.

[8] 萬(wàn)怡震.? 中國(guó)葡萄屬野生種抗病性及抗病基因 RAPD 標(biāo)記作圖研究[D].? 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003：5-6.

[9] 呂秀蘭.? 葡萄品種遺傳多樣性和霜霉病抗性鑒定的生化與分子生物學(xué)研究[D].? 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005：

4-12.

[10] 吉麗麗.? 石河子地區(qū)葡萄霜霉病菌孢子囊時(shí)空擴(kuò)散動(dòng)態(tài)及品種抗病性研究[D].? 石河子：石河子大學(xué)，2011：35.

[11] 王國(guó)英.? 葡萄葉片氣孔與霜霉病抗性[J].? 果樹(shù)科學(xué)，1988，5（3）：120-121.

[12] 李? ?華.? 葡萄抗病和感病品種葉片氣孔對(duì)霜霉病游動(dòng)孢子的向性引力比較研究[J].? 法國(guó)農(nóng)業(yè)通訊，1986（1）：27-30.

[13] 劉天明，李? ?華，張振文.? 鮮食葡萄品種對(duì)霜霉病的抗性及抗病機(jī)理研究[J].? 植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2001，

28（2）：118-122.

[14] 劉新秀，金恭璽，李? ?虎，等.? 葡萄種質(zhì)資源抗霜霉病鑒定[J].? 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，50（5）：857-863.

[15] 陳佰鴻，李新生，曹孜義，等.? 一種用透明膠帶粘取葉片表皮觀察氣孔的方法[J].? 植物生理學(xué)通訊，2004，40（2）：215-218.

[16] BOUBALS. D.? A contribution to the study of causes of the resistance of vitaceae to downy mildew and their mode inheritance[J].? Plant Breeding Abstracts，1959，

12（30）：151.

（本文責(zé)編：陳? ? 珩）