反相高效液相色譜法測定東北地區(qū)6種紅樹莓果實(shí)中鞣花酸含量

王金玲，李亮亮，呂長山

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

反相高效液相色譜法測定東北地區(qū)6種紅樹莓果實(shí)中鞣花酸含量

王金玲1，李亮亮1，呂長山2

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

建立反相高效液相色譜法 測定 東北地區(qū)6種紅樹莓果實(shí)中鞣花酸含量，同時與藍(lán)莓進(jìn)行比較 分析。色譜條件：色譜柱Si noChrom DS-BP C18（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為CH3OH-0.3%磷酸（40∶60，V/V）；流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測波長254 nm。結(jié)果表明：鞣花酸得到很好地分離，鞣花酸含量在0.1～1μg范圍內(nèi)與峰面積 呈良好的線性關(guān)系，R2為0.999 3。精密度實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.06%，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%，平均加樣回 收率為93.00%～98.62%，相 對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～0.42%，該方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好。測得不同品種紅樹莓果實(shí)中總鞣花酸含量為39.10～155.98 mg/100 g；游離鞣花酸含量為1.24～8.26 mg/100 g，紅樹莓中含有豐富的鞣花酸，具有潛在的開發(fā)利用價值。

紅樹莓；鞣花酸；反相高效液相法

紅樹莓為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubusspp.）多年生灌木型植物，也叫托盤、馬林果、覆盆子等。果實(shí)酸甜可口，具有較高的營養(yǎng)價值和保健價值[1-4]，其中鞣花酸是紅樹莓果實(shí)中重要的功能成分[5]。鞣花酸又叫并沒食子酸，是沒食子酸的二聚衍生物，屬于多酚二內(nèi)酯，結(jié)構(gòu)如圖1所示。天然的鞣花酸廣泛存在于各類漿果、堅(jiān)果等植物組織和果實(shí)中，如草莓、石榴、板栗、龍眼、芒果等[6-9]。自然界中以游離形式存在的鞣花酸較少，主要以鞣花單寧的形式存在，經(jīng)過酸水解后釋放鞣花酸。大量研究表明鞣花酸具有抗氧化、抗炎、抗癌等活性功能[10-16]。因此，受到眾多學(xué)者的關(guān)注，逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

東北地區(qū)是我國紅樹莓的主產(chǎn)區(qū)，資源豐富，種植歷史久，規(guī)模大，品種多。對本地區(qū)紅樹莓中鞣花酸的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了一種反相高效液相色譜法測定6種紅樹莓果實(shí)中總鞣花酸和游離鞣花酸含量，同時與藍(lán)莓進(jìn)行比較分析，該方法能夠快速、準(zhǔn)確地測定出鞣花酸含量，從而可以明確不同品種紅樹莓鞣花酸含量及品種間含量差異，為東北地區(qū)紅樹莓鞣花酸的相關(guān)研究、產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

圖1 鞣花酸化學(xué)結(jié)構(gòu)[17]Fig.1 Chemical structure of ellagic acid

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

紅樹莓，野生品種；歐洲紅、紅寶石、哈瑞太茲、菲爾杜德、秋福，均為紅樹莓栽培品種，2013年7月采自哈爾濱市尚志市，成熟度好；藍(lán)莓：北陸，為栽培品種，2013年7月采自哈爾濱市五常市，成熟度好。

鞣花酸對照品（純度大于98%） 南京森貝伽生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 賽默飛世爾（中國）有限公司；水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；二甲基亞砜、甲醇（均為分析純） 天津富宇精細(xì)化工有限公司；鹽酸（分析純） 北京化工廠。

1260高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；恒溫水浴鍋 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；0.45μm微孔濾膜天津市奧特賽恩斯儀器有限公司；FA-2004型電子天平上海天平儀器廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1色譜條件

色 譜 柱 為S i n o C h r o m D S-B P C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為CH3OH-0.3%磷酸（40∶60，V/V），流速1 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL，檢測波長254 nm。

1.2.2對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取鞣花酸對照品12.50 mg，置于25 mL量瓶中，用二甲亞砜溶解并稀釋至刻度，搖勻。經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，制成0.5 mg/mL溶液，作為對照品溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用對照品溶液配制成0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用高效液相色譜法測定，進(jìn)樣量10μL， 測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，鞣花酸質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，繪制鞣花酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程。

1.2.4游離鞣花酸含量測定

取研磨后的5 g紅樹莓勻漿，加入90%甲醇溶液50 mL，室溫提取8 h，超聲處理30 min，抽濾，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)枚讈嗧咳芙猓ㄈ萦?00 mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，用于高效液相色譜分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其鞣花酸含量。

1.2.5總鞣花酸含量測定

取研磨后的5 g樹莓勻漿，加入酸化的甲醇（含1.2 mol/L鹽酸）50 mL，85℃回流8 h，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘?jiān)枚讈嗧咳芙?，定容?00 mL容量瓶中，經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過濾，用于高效液相色譜分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其鞣花酸含量。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用Word、Excel、SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。結(jié)果表示為 ±s。

2 結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

以峰面積為縱坐標(biāo)，鞣花酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制鞣花酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=132 261x-45.527，R2=0.999 3。

2.2精密度

分別精密吸取已知質(zhì)量濃度的鞣花酸對照品溶液和某一品種紅樹莓水解后樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測定總鞣花酸的峰面積。結(jié)果測得，總鞣花酸對照品峰面積分別為5 209.19、5 209.95、5 269.61、5 244.59、5 229.35，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.41%；紅樹莓樣品峰面積分別為10 274.60、10 265.60、10 268.40、10 267.00、10 257.40，峰面積RSD為0.06%，表明測定結(jié)果精密度良好。

2.3重復(fù)性

取某一品種紅樹莓樣品5份，分別按總鞣花酸含量測定方法處理，分別進(jìn)樣，測定鞣花酸峰面積。結(jié)果顯示，峰面積RSD為0.09%，表明樣品處理過程和測定方法重復(fù)性好。

2.4穩(wěn)定性

取某一品種紅樹莓水解后樣品溶液室溫條件下分別放置0、2、4、6、8 h后進(jìn)樣測定峰面積，結(jié)果顯示峰面積RSD為0.39%，說明鞣花酸性質(zhì)穩(wěn)定。

2.5回收率

吸取某一品種紅樹莓水解后樣品溶液5 mL，共3份，測定出其實(shí)際含量，然后分別加入質(zhì)量濃度為0.06、0.08、0.10 mg/mL的鞣花酸對照品溶液5 mL，得到混合樣品。進(jìn)樣10μL，每次加標(biāo)測定3次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率，結(jié)果如表1所示，計(jì)算得平均加標(biāo)回收率為93.00%～98.62%，RSD為0.21%～0.42%。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of recovery tests

2.6樣品分析

圖2 0.04 mg/mL鞣花酸對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of 0.04 mg/mL ellagic acid standard

圖3 紅樹莓樣品總鞣花酸色譜圖（以菲爾杜德品種為例）Fig.3 HPLC chromatogram of total ellagic acid from red raspberry sample (Ferlod i as an example)

圖4 紅樹莓樣品游離鞣花酸色譜圖（以菲爾杜德品種為例）Fig.4 HPLC chromatogram of free ellagic acid from red raspberry sample (Ferlodi as an example)

將鞣花酸對照品和不同品種紅樹莓樣品溶液按照1.2.1節(jié)色譜條件分別進(jìn)樣分析。鞣花酸對照品色譜圖與紅樹莓鞣花酸色譜圖如圖2～4所示。根據(jù)圖2鞣花酸對照品色譜峰保留時間確定出紅樹莓樣品中總鞣花酸和游離鞣花酸色譜峰。

2.7樣品測定結(jié)果

表2 不同品種紅樹莓鞣花酸含量Table 2 The contents of ellagic acid from different red raspberry cultivars mg/100 g

由表2可知，6個品種紅樹莓總鞣花酸含量為39.10～155.98 mg/100 g，野生品種鞣花酸含量最高，紅寶石品種含量最低，且野生品種鞣花酸含量顯著高于栽培品種，是紅寶石品種的近4倍，與藍(lán)莓相比，紅樹莓總鞣花酸含量遠(yuǎn)高于藍(lán)莓。紅樹莓果實(shí)中游離鞣花酸含量少，在1.24～8.26 mg/100 g范圍內(nèi)，在藍(lán)莓中未檢測到游離鞣花酸，可能藍(lán)莓中游離鞣花酸含量極少甚至沒有。紅樹莓果實(shí)中游離鞣花酸遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于總鞣花酸含量，說明在紅樹莓果實(shí)中鞣花酸主要以鞣花單寧形式存在，較少以游離鞣花酸形式存在。

Bobinaite等[18]測得不同紅樹莓品種中游離鞣花酸為2.0～5.5 mg/100 g，通過酸水解后的總鞣花酸含量為119.8～323.5 mg/100 g。與本實(shí)驗(yàn)測定的結(jié)果具有一定的相似性。李小萍等[19]利用高效液相色譜法測定紅樹莓中水解后鞣花酸含量為223 mg/kg，張成濤等[20]利用高效液相色譜法測定紅樹莓果實(shí)中水解鞣花酸含量為43.5 mg/g，與本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果有差異，可能跟品種、種植環(huán)境、種植氣候等因素有關(guān)。

3 討 論

鞣花酸作為紅樹莓中一種具有重要保健價值的天然活性物質(zhì)，有必要對其準(zhǔn)確測定。目前有很多種測定鞣花酸的方法，如紫外分光光度法[21]、高效毛細(xì)管電泳法[22]等，但高效液相色譜法因其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)被廣泛運(yùn)用于鞣花酸含量測定[23-25]。高效液相色譜法對紅樹莓鞣花酸定量測定已有報(bào)道，為本實(shí)驗(yàn)的開展提供了參考。由于紅樹莓樣品中復(fù)雜多樣的成分和色譜條件，如色譜柱、流動相的選擇與配比、流動相pH值、流速、柱溫等，都會影響目標(biāo)成分的分離效果，流 動相選擇與配比是影響分離效果的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)在參考相關(guān)報(bào)道的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件，選擇以CH3OH-0.2%三氟乙酸、CH3OH-0.3%三氟乙酸[19]、CH3OH-0.2%磷酸、CH3OH-0.3%磷酸[20]（50∶50，V/V）作為流動相時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種流動相的鞣花酸色譜峰出峰時間早，均低于5 min，但以CH3OH-0.3%磷酸（50∶50，V/V）為流動相的色譜峰峰形最好，于是進(jìn)一步調(diào)整CH3OH-0.3%磷酸體積比，發(fā)現(xiàn)體積比為40∶60時鞣花酸色譜峰出峰時間更適宜，且沒有雜峰干擾，分離度高，鞣花酸得到很好的分離，因此確定流動相為CH3OH-0.3%磷酸（40∶60，V/V）。從色譜條件看，以CH3OH-0.3%磷酸為流動相，無需其他特殊試劑，低毒、簡單易得、成本低。從色譜圖看，出峰時間大約為10 min，測定時間適宜，可以快速進(jìn)行分析，且基線平穩(wěn)，鞣花酸與其他物質(zhì)分離效果好，受其他物質(zhì)影響較小。該方法適合于紅樹莓鞣花酸的測定分析。

回流提取時間影響鞣花酸的含量，回流提取時間短，鞣花單寧水解不完全，時間過長，鞣花酸易氧化而降低。Bobinaite等[18]分別測定回流提取4、8、16、20 h時鞣花酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鞣花酸含量先升高后降低，在回流提取8 h時鞣花酸含量最高。根據(jù)上述結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇回流提取時間為8 h，但是對于本實(shí)驗(yàn)中不同的紅樹莓品種，8 h是否為最佳回流提取時間，以及提取回流時間對其鞣花酸的影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對東北地區(qū)不同品種紅樹莓果實(shí)中鞣花酸含量測定結(jié)果表明：紅樹莓果實(shí)中總鞣花酸含量豐富，為39.10～155.98 mg/100 g；但游離鞣花酸含量很低，為1.24～8.26 mg/100 g，遠(yuǎn)低于總鞣花酸含量。此外，紅樹莓果實(shí)中總鞣花酸含量遠(yuǎn)高于藍(lán)莓。紅樹莓是理想的天然鞣花酸來源，具有巨大的利用價值。

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Determination of Ellagic Acid from Six Red Raspberry Cultivars Grown in Northeast China Using RP-HPLC

WANG Jinling1, LI Liangliang1, L? Changshan2
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. School of Applied Technology, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

A reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to determine the contents of ellagic acid in six red raspberry cultivars grown in northeast China. Meanwhile, the results were compared with those of the blueberry fruit. A SinoChrom DS-BP C18column (150 mm×4.6 mm, 5μm) was used to separate ellagic acid; the mobile phase was a mixture of 0.3%phosphate and methanol solution (60:40,V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min; the column temperature was set at 30 ℃ and the UV detection wavelength was 254 nm. Our results indicated that ellagic acid could be separated well, and a good linear relationship appeared between the content of ellagic acid in the range of 0.1-1μgand peak area with correlation coefficient of 0.999 3. The relative standard deviation (RSD) was 0.06%for precision, 0.09%for reproducibility, and 0.39%for stability. The average recovery rates of ellagic acid from spiked samples were between 93.00%and 98.62%with RSD of 0.21%-0.42%. The proposed method is convenient, accurate, and repeatable. The contents of total ellagic acid in different red raspberry cultivars varied from 39.10 to 155.98 mg/100 g, and the content of free ellagic acid was in the range of 1.24 to 8.26 mg/100 g. Red raspberry is rich in ellagic acid, and it could be fully developed and utilized.

red raspberry; ellagic acid; reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)

S663.2

A

1002-6630（2015）12-0093-04

10.7506/spkx1002-6630-201512017

2014-10-26

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2572014CA14）

王金玲（1975—），女，副教授，博士，主要從事植物源活性物質(zhì)研究。E-mail：Wangjinling08@163.com