楊樹(shù)腐爛病菌與不同寄主互作后致病力分化研究

嚴(yán)海璘 張王斌 朱宗財(cái) 儀子博 王飛亞 岳娟

摘要： 將DSYS菌株接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條及葉片上進(jìn)行發(fā)病率、顯癥時(shí)間、產(chǎn)孢體出現(xiàn)時(shí)間、病斑擴(kuò)展速度的研究結(jié)果表明，DSYS菌株均能使4種不同寄主健康的枝條發(fā)病，在胡楊和灰楊枝條上第3 d開(kāi)始顯癥，顯癥時(shí)間最早；在新疆楊枝條上第10 d開(kāi)始顯癥，顯癥時(shí)間最晚，且產(chǎn)孢體形成需要時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)到14 d；在銀白楊枝條上病斑擴(kuò)展速度最快，為1.46 cm/d。DSYS菌株經(jīng)歷不同寄主培養(yǎng)后，繼代菌株在病斑擴(kuò)展速度和發(fā)病特征上發(fā)生明顯分化現(xiàn)象，在新疆楊和灰楊連續(xù)培養(yǎng)3代后病斑擴(kuò)展速度呈增加趨勢(shì)且達(dá)到顯著性差異，在胡楊連續(xù)培養(yǎng)3代后病斑擴(kuò)展速度沒(méi)有達(dá)到顯著性差異，在銀白楊上連續(xù)培養(yǎng)后病斑擴(kuò)展速度在繼2代與繼1代和繼3代表現(xiàn)上有顯著性差異。

關(guān)鍵詞： 楊樹(shù)腐爛病菌； 致病性； 抗病性； 擴(kuò)展速度； 產(chǎn)孢體

中圖分類號(hào)： S 718. 8， S 792. 11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1001 - 9499 （2018） 02 - 0020 - 05

楊樹(shù)是新疆主要防護(hù)林樹(shù)種之一，在綠洲農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起著極其重要的作用。近年來(lái)，楊樹(shù)腐爛?。–ytospora chrysosperma）發(fā)生蔓延迅速，造成大面積防護(hù)林帶死亡，給脆弱的的綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)帶來(lái)極大的威脅。新疆是林木腐爛病發(fā)生最嚴(yán)重的地區(qū)之一， 其中楊樹(shù)腐爛病的發(fā)生程度最為嚴(yán)重[ 1 - 4 ]。通過(guò)測(cè)定4種不同寄主對(duì)楊樹(shù)腐爛病菌的抗病性和不同寄主繼代菌株的致病性，為進(jìn)一步探索楊樹(shù)與腐爛病間的互作及進(jìn)行抗病育種提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 供試菌種

供試菌種為南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的楊樹(shù)腐爛病菌菌株DSYS，分離于阿拉爾11團(tuán)的楊樹(shù)發(fā)病枝條上，按常規(guī)的組織分離法[ 5 ]分離，經(jīng)單孢分離后獲得純菌株，用甘油管藏法在-80 ℃冰箱中保存，試驗(yàn)前在PDA平板上25 ℃全光照培養(yǎng)3天活化以備用。

1. 1. 2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，加蒸餾水1 000 ml，沸水煮30 min后過(guò)濾上清液，加入蒸餾水補(bǔ)至總體積1 000 ml，加瓊脂20 g，葡萄糖20 g，煮至瓊脂融化，121 ℃，30 min高溫滅菌備用。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 枝條組織燙傷法

在阿拉爾市塔里木大學(xué)校園內(nèi)于下午15時(shí)至16時(shí)采集1～2年生健康且生長(zhǎng)一致的新疆楊（Populus bolleana）、銀白楊（Populus alba）下部枝條；在阿拉爾市塔里木大學(xué)東門(mén)外于下午15時(shí)至16時(shí)采集1～2年生健康且生長(zhǎng)一致的胡楊（Populus euphratica）、灰楊（Populus pruinosa）下部枝條。將采集的枝條截成15cm長(zhǎng)小段，先用蒸餾水沖洗枝條3遍，之后用75%酒精擦拭，再用無(wú)菌水沖洗3遍。將無(wú)菌打孔器在酒精燈上燒熱后在枝條上打出直徑5 mm的圓形傷口，再將DSYS菌株用打孔器打成直徑5 mm菌餅接種在傷口處。然后將接種好的同一樹(shù)種的枝條每10支放在一個(gè)消毒盤(pán)中，消毒盤(pán)底部用一層紗布鋪墊，并倒入適量無(wú)菌水保濕，最后用保鮮膜將消毒盤(pán)口封住，在25 ℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

1. 2. 2 葉片組織針刺法

葉片組織針刺法采[ 6 ]用10針針刺法接種腐爛病菌。在南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周圍，于下午15時(shí)至16時(shí)采集健康且生長(zhǎng)大致相同的新疆楊葉片若干，將葉片用蒸餾水沖洗3遍后，用75%酒精表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗3遍后備用。將消毒針燒紅滅菌，在葉片正面刺10針，刺傷部位應(yīng)均勻分布在直徑5 mm的圓形區(qū)域內(nèi)，并避開(kāi)葉片主脈。將直徑5 mm菌餅接種在針刺處，接種好的葉片放于大塑料皿中，皿內(nèi)用紗布鋪墊，倒入適量無(wú)菌水保濕，每個(gè)皿內(nèi)放一片葉片，在25 ℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

1. 2. 3 繼代菌株的獲取

采用組織燙傷法將DSYS菌株分別接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條上，待顯癥并出現(xiàn)白色產(chǎn)孢體后，進(jìn)行分離和純化，獲得不同寄主的繼1代菌株，即新疆楊繼1代菌株、銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株，采用上述方法，將不同寄主繼1代菌株接種到新的枝條上進(jìn)行培養(yǎng)、分離和純化，繼而獲得不同寄主繼2代菌株和繼3代菌株。

1. 3 研究?jī)?nèi)容

1. 3. 1 DSYS菌株對(duì)4種寄主的致病性

采用枝條組織燙傷法將DSYS菌株分別接種到新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊枝條上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察、記錄其在各寄主上的發(fā)病率、開(kāi)始顯癥時(shí)間、產(chǎn)孢體形成時(shí)間和病斑擴(kuò)展速度（采用十字交叉法）。

1. 3. 2 不同寄主繼1代菌株對(duì)新疆楊的致病性

將新疆楊繼1代菌株、銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株采用枝條組織燙傷法及葉片組織針刺法接種在新疆楊枝條及葉片上，觀察、記錄不同寄主繼1代菌株在新疆楊枝條及葉片上的發(fā)病率、開(kāi)始顯癥時(shí)間、產(chǎn)孢體形成時(shí)間和病斑擴(kuò)展速度。

1. 3. 3 不同寄主繼2代和繼3代菌株對(duì)新疆楊的致病性

將不同寄主繼2代菌株和繼3代菌株采用葉片組織針刺法接種在新疆楊葉片上，觀察、記錄不同寄主繼2代和繼3代菌株在新疆楊葉片上的發(fā)病率、開(kāi)始顯癥時(shí)間、病斑擴(kuò)展速度和發(fā)病特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSYS菌株對(duì)4種寄主的致病性

試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，DSYS菌株均能使健康的楊樹(shù)枝條發(fā)病。胡楊、灰楊與新疆楊枝條開(kāi)始顯癥時(shí)間明顯不同，胡楊和灰楊的枝條最早發(fā)病，新疆楊的枝條最晚發(fā)病?；覘钪l在第8天形成產(chǎn)孢體，而新疆楊枝條在第14天出現(xiàn)產(chǎn)孢體。病斑擴(kuò)展速度在不同寄主上存在明顯差異，其中銀白楊和胡楊間達(dá)到了顯著性差異。新疆楊枝條的產(chǎn)孢體較少且稀疏，銀白楊和胡楊產(chǎn)孢體特征相同；灰楊枝條形成的產(chǎn)孢體較多且主要集中在病斑周圍，與其它3種不同寄主枝條產(chǎn)孢體特征有較大差異。

2. 2 不同寄主繼1代菌株對(duì)新疆楊的致病性

將4種不同寄主繼1代菌株接種到新疆楊枝條和葉片上的觀測(cè)結(jié)果（表2）表明，4種不同寄主繼1代菌株均能使新疆楊枝條和葉片發(fā)病，發(fā)病率一致。4種不同寄主繼1代菌株接種新疆楊枝條后第3天開(kāi)始顯癥；接種新疆楊葉片后，銀白楊繼1代菌株較其它3種寄主繼1代菌株開(kāi)始顯癥時(shí)間晚1天?；覘罾^1代菌株接種新疆楊枝條后形成產(chǎn)孢體時(shí)間最早，新疆楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后形成產(chǎn)孢體時(shí)間最晚，銀白楊繼1代菌株和胡楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后形成產(chǎn)孢體的時(shí)間相同。銀白楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后病斑擴(kuò)展速度最快，胡楊繼1代菌株接種新疆楊枝條后病斑擴(kuò)展速度最慢，且4種楊樹(shù)繼1代菌株接種新疆楊枝條后的病斑擴(kuò)展速度存在顯著性差異。胡楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后產(chǎn)生的病斑擴(kuò)展速度最快，銀白楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后產(chǎn)生的病斑擴(kuò)展速度最慢，且銀白楊繼1代菌株、胡楊繼1代菌株和灰楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度存在顯著性差異，銀白楊繼1代菌株和新疆楊繼1代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度無(wú)顯著性差異。

2. 3 不同寄主繼2代菌株對(duì)新疆楊的致病性

觀測(cè)結(jié)果（表3）表明，4種不同寄主繼2代菌株均能使新疆楊葉片發(fā)病，且發(fā)病率均為100%。胡楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度最快，銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度最慢。新疆楊繼2代菌株、銀白楊繼2代菌株和胡楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度有顯著性差異，胡楊繼2代菌株和灰楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度無(wú)顯著性差異。4種不同寄主繼2代菌株接種新疆楊葉片后病斑均呈黑褐色，且侵染完全后葉片均呈褐色，散發(fā)茶葉味。新疆楊繼2代菌株和銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后都是從葉片邊緣開(kāi)始發(fā)病，而胡楊繼2代菌株和灰楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后都是從針刺部位開(kāi)始發(fā)病。

2. 4 不同寄主繼3代菌株對(duì)新疆楊的致病性

觀測(cè)結(jié)果（表4）表明，4種不同寄主繼3代菌株均能使新疆楊葉片發(fā)病，且發(fā)病率均為100%。銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后第2天才開(kāi)始發(fā)病?；覘罾^3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度最快，銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度最慢。4種楊樹(shù)繼3代菌株接種新疆楊葉片后病斑擴(kuò)展速度有顯著性差異。新疆楊繼3代菌株、胡楊繼3代菌株和灰楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后發(fā)病時(shí)均從針刺部位開(kāi)始出現(xiàn)黑褐色病斑，且侵染完全后葉片呈褐色散發(fā)茶葉味，而銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后黑褐色病斑分散在葉片表面及周圍，只有很淡的茶葉味。

2. 5 4種不同寄主不同繼代菌株致病力的變化

新疆楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，開(kāi)始發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率相同，病斑擴(kuò)展速度隨代數(shù)的增加而增加，且存在顯著性差異。銀白楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，發(fā)病率相同，開(kāi)始發(fā)病時(shí)間減少后又增加，病斑擴(kuò)展速度增加后又減少，且銀白楊繼2代菌株接種新疆楊葉片后的病斑擴(kuò)展速度與銀白楊繼1代和銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后的病斑擴(kuò)展速度存在顯著性差異，銀白楊繼1代與銀白楊繼3代菌株接種新疆楊葉片后在病斑擴(kuò)展速度上無(wú)顯著性差異。胡楊不同繼代菌株接種到新疆楊葉片上，開(kāi)始發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率相同，病斑擴(kuò)展速度增加后又減少，但是3代之間病斑擴(kuò)展速度無(wú)顯著性差異?；覘畈煌^代菌株接種到新疆楊葉片上，開(kāi)始發(fā)病時(shí)間和發(fā)病率相同，病斑擴(kuò)展速度隨代數(shù)增加而增加，且存在顯著性差異（圖1）。

3 結(jié) 語(yǔ)

3. 1 4種不同寄主對(duì)來(lái)源于腐爛病菌DSYS菌株的抗性在不同方面的表現(xiàn)存在明顯差異，新疆楊接種后潛育期較長(zhǎng)且產(chǎn)孢體形成需要時(shí)間較長(zhǎng)，但在胡楊上潛育期較短，病斑擴(kuò)展速度較慢。DSYS菌株經(jīng)歷不同寄主培養(yǎng)后，繼代菌株致病力發(fā)生明顯分化現(xiàn)象，在胡楊上連續(xù)培養(yǎng)3代后致病性變化沒(méi)有達(dá)到顯著性差異，在新疆楊和灰楊上連續(xù)培養(yǎng)后致病性呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì)且達(dá)到顯著差異，在銀白楊上連續(xù)培養(yǎng)后致病性表現(xiàn)出不穩(wěn)定現(xiàn)象。

3. 2 將楊樹(shù)腐爛病菌DSYS接種在新疆楊、銀白楊、胡楊和灰楊離體枝條上的觀測(cè)結(jié)果表明，DSYS菌株均能使4種不同寄主感病，但感病程度在顯癥時(shí)間、產(chǎn)孢體形成時(shí)間和發(fā)病特征上有所差異，這與杜琴等[ 2 ]研究結(jié)果：同一菌株對(duì)不同寄主的致病力有差異的結(jié)論基本一致，但造成致病力差異的原因和機(jī)理有待于深入的研究。

3. 3 繼代培養(yǎng)一般會(huì)引起微生物退化，但也不排除使微生物增強(qiáng)適應(yīng)性的可能。蔡國(guó)貴等對(duì)白僵菌進(jìn)行繼代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn) 11 次繼代培養(yǎng)后不但沒(méi)有引起退化，其毒力還有所增強(qiáng)[ 7 - 8 ]。將4種寄主繼1代菌株接種到新疆楊枝條上發(fā)現(xiàn)，顯癥時(shí)間相同，但新疆楊繼1代菌株在新疆楊枝條上的潛伏期較長(zhǎng)，病斑擴(kuò)展速度較慢，這與孔利等[ 9 ]：不同寄主來(lái)源的 C.sacculus菌株對(duì)原分離寄主枝條的致病力最強(qiáng)，對(duì)其他樹(shù)種枝條的致病力較弱的結(jié)論有明顯差異。將不同寄主繼代菌株接種新疆楊上發(fā)現(xiàn)，新疆楊繼代菌株接種新疆楊上的致病力并不強(qiáng)于其它3種不同寄主菌株接種新疆楊上的致病力，這與陳曉忍等[ 10 ]不同寄主來(lái)源的腐爛病菌在自身寄主上的致病力較在其它寄主上強(qiáng)的結(jié)論有明顯差異。本研究表明，新疆楊繼代菌株和灰楊繼代菌株隨繼代次數(shù)增加致病力增強(qiáng)，銀白楊繼代菌株和胡楊繼代菌株隨繼代次數(shù)增加致病力先增強(qiáng)后減弱，這與劉海英[ 11 ]等：隨繼代次數(shù)增加，菌絲生長(zhǎng)速度變慢、產(chǎn)孢量下降、分生孢子變小、致病性顯著降低、表現(xiàn)出明顯退化現(xiàn)象有明顯差異，其原因可能是由于在不同寄主上連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行互作后引起的。摸清楊樹(shù)腐爛病菌對(duì)4種楊樹(shù)的致病性強(qiáng)弱和楊樹(shù)被腐爛病侵染時(shí)的抗性還需做進(jìn)一步的酶活性分子實(shí)驗(yàn)。

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第1作者簡(jiǎn)介： 嚴(yán)海璘（1996-）， 男， 本科生， 研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)。

通訊作者： 張王斌（ 1974-）， 男， 副教授， 研究方向?yàn)榱止麡?shù)木腐爛病。

（責(zé)任編輯： 王 岳）